Carboxymethyl cellulose-based cryogels as scaffolds for pancreatic and skeletal muscle tissue engineering

Abstract

[eng] Diabetes incidence highly increased in the last years. According to IDF (International Diabetes Federation), 463 million people suffered this disease in 2019. The estimations of diabetic people highly increase in the upcoming years, rising approximately to 700 million diabetic patients in 2045 [1]. Type 2 diabetes (T2D) is the most common type of diabetes, representing 90% of diabetic patients. It occurs when the body becomes resistant to insulin. Body insulin resistance confirms that T2D is not only a pancreatic disease, as there are many other tissues involved, like liver, adipose tissue, or skeletal muscle. This last has a significant implication in glucose-insulin homeostasis as it is one of the main glucose-consuming organs in the body. Nowadays, to study how two tissues crosstalk between them, animal testing is the gold standard. However, the unmatching physiological behaviors compared to humans, the variability between different animals, ethical dilemmas, and the need to go for more personalized medicine activates the search for other suitable alternatives. At this point, Organs-on-a-chip appeared as a valid alternative. Organs-on-a-chip (OOC) are 3D bioengineered microfluidic cell culture platforms to simulate microphysological environments of an organ or its specific functions. Nowadays, to engineer the tissues for OOC applications, encapsulating cells inside hydrogels is the most common technique. Its beneficial properties include high water content, mechanical adjustability, and moldability to generate the desired architectures [2]. However, its small porosity limits nutrient and oxygen diffusion through it [3]. This problem is a significant limitation when pancreatic islets are encapsulated inside hydrogels due to their size (~100 μm of diameter). Pancreatic islets are cell aggregations composed of many different cells as insulin-secreting cells (Beta-cells) or glucagon-secreting cells (alpha-cells). Similarly, skeletal muscle tissue is generally encapsulated in small bundles. Skeletal muscle is a highly aligned and multinucleated tissue formed from the fusion of single cells, called myoblasts, into multinucleated cells, called myotubes. Cryogels have been proposed as a valid alternative to overcome these limitations. Cryogels are fabricated by crosslinking a prepolymer solution at sub-zero temperatures, so while the material crosslinks, water freezes, generating the desired micropore architecture. After thawing, cryogels are sponge-like scaffolds with microporous structure, high interconnected porosity, high diffusivity, fine-tuned properties, and desired internal pore architecture.

This thesis developed two cryogel scaffolds made of gelatin and carboxymethylcellulose with different pore architectures to engineer pancreatic and skeletal muscle tissues. Here, we proved that the achieved pore architecture fits with the prerequisites to engineer each tissue. Moreover, the mechanical and physical properties of each scaffold highly resemble the 3D microenvironment of each tissue. In pancreatic tissue, we generate a random pore cryogel to aggregate beta-cells to form pseudoislets. We proved that these engineered pseudoislets are viable, functional responding correctly to the glucose and improving insulin response compared to monolayer results. In the skeletal muscle approach, we could develop a highly aligned pore architecture to prompt cell alignment and cell fusion. Moreover, we incorporate carbon nanotubes to enhance the electrical conductivity of the scaffold, so by applying electrical pulse stimulation, we could improve the early steps of the myogenic maturation.

[cat] La incidència de la diabetis ha augmentat considerablement en els últims anys. Segons l’IDF (International Diabetes Federation), al 2019 hi havia 463 milions de persones que patien diabetis i les estimacions estimen un augment considerable de casos, arribant als 700 milions de persones diabètiques cap al 2045 [1]. Entre els diferents tipus de diabetis, la diabetis tipus 2, és la que té major incidència en la població, corresponent al 90% dels casos de pacients amb diabetis. Aquest tipus de diabetis, succeeix quan el cos es torna resistent a la insulina. Aquesta resistència a la insulina per part dels teixits perifèrics ens prova que la diabetis no és només una malaltia del pàncreas, sinó que hi ha altres teixits relacionats, com el fetge, el teixit adipós o el múscul esquelètic. Aquest últim té un factor molt rellevant en la homeòstasi de la insulina i la glucosa, ja que és un dels principals teixits consumidors de glucosa. La interacció, però, entre aquest dos teixits encara presenta molts interrogants. Actualment, per estudiar com dos teixits interactuen entre ells, el testeig animal és el mètode més confiable. No obstant, presenta certes limitacions, com la poca similitud en quan a l’activitat dels illots, la variabilitat fisiològica entre diferents animals, dilemes ètics o la necessitat d’encarar la recerca cap a una medicina més personalitzada. Aquesta finalitat és el que ha portat als científics a buscar alternatives a l’experimentació animal. Entre moltes, una de les més prometedores són els anomenats Òrgans-en-un-xip, plataformes 3D de cultiu cel·lular combinades amb microfluídica i biomaterials que permeten simular les funcions específiques d’un òrgan. Per tal de generar el teixit dins d’aquesta plataforma, l’encapsulació de cèl·lules dins de hidrogels és la tècnica més utilitzada, degut al seu alt contingut d’aigua, la seva adaptabilitat mecànica o la possibilitat de generar una certa estructura geomètrica [2]. No obstant, la seva petita porositat, limita la difusió homogènia d’oxigen i de nutrients dins seu [3]. Aquest problema creix quan es volen encapsular illots pancreàtics en bastides d’hidrogel, degut a la seva mida (~100 μm de diàmetre). Els illots pancreàtics són agregacions de varis tipus diferent de cèl·lules, on destaquen les cèl·lules secretores de insulina (cèl·lules beta) i les secretores de glucagó (cèl·lules alfa). Per altre costat, el teixit muscular s’encapsula en petits constructes per tal d’imitar l’estructura d’aquest. El múscul esquelètic és un teixit altament alineat, amb cèl·lules multi nucleades, anomenades miotubs, que s’obtenen a partir de la fusió de cèl·lules soles, anomenades mioblasts. Per tal de solucionar aquests problemes, els criogels han aparegut com a alternativa. Els criogels, estan fabricats a temperatures sota zero, així mentres el polímer crosslinca es formen cristalls de gel. Un cop formada la matriu, la

bastida es descongela i aquests cristalls es desfaran, deixant pas a espais buits, anomenats pors. Aquests, seran els que posteriorment li donaran la l’estructura porosa, altament interconnectada, amb alta permeabilitat i amb una arquitectura de pors determinada a la nostra bestida. En aquesta tesi s’han desenvolupat dos bastides de cel·lulosa carboxymetilada diferents seguint la tècnica de la criogelificació. Cada bastida ha estat dissenyada per tenir una distribució i una arquitectura de pors diferent d’acord amb la necessitat i propietat del teixit que es vulgui generar. A més, les propietats físiques i mecàniques de les dos bastides tenen alta semblança amb les propietats físiques i mecàniques de la matriu extracel·lular de cada teixit. Per el teixit pancreàtic, s’ha generat una bastida amb un diàmetre de pors similar als illots pancreàtics, per tal que, sembrant cèl·lules beta, aquestes formin pseudoillots similars als illots fisiològics. A més, s’ha demostrat que aquests illots tenen el diàmetre i la arquitectura desitjada, són viables i capaços de respondre a diferents nivells de glucosa. A més, s’ha demostrat que aquestes cèl·lules agregades en forma de pseudoillots responen millor a la glucosa que les cèl·lules configurades en distribució dispersa. En el cas del múscul esquelètic, s’ha desenvolupat una bastida amb una arquitectura de pors altament alineada per promoure l’alineament cel·lular i la fusió cel·lular. A més, s’han pogut incorporar nanotubs de carboni per millorar les propietats elèctriques de la vestida. D’aquesta manera, aplicant pulsos elèctrics per estimular el teixit, s’han pogut millorar les etapes primerenques de la maduració miogènica.