Evaluación de ensayos de alta sensibilidad para mejorar la identificación y el seguimiento de individuos con síndromes de cáncer hereditario asociados a deficiencia de reparación de errores de apareamiento

Abstract

[spa] Tanto las variantes patogénicas como las epimutaciones constitucionales en los genes del sistema de reparación de errores de apareamiento (mismatch repair, MMR), MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2, son responsables de los síndromes de predisposición hereditaria a cáncer asociados a deficiencia de este sistema de reparación: el síndrome de Lynch (SL), causado por (epi)mutaciones monoalélicas, y el Síndrome de Deficiencia Constitucional de Reparación de Apareamientos Erróneos (Constitutional Mismatch Repair Deficiency, CMMRD), causado por inactivación bialélica. Los individuos con ambos síndromes desarrollan un amplio espectro de tumores en edad adulta y pediátrica (respectivamente), caracterizados por la pérdida de expresión de las proteínas MMR e inestabilidad de microsatélites (MSI). En los últimos años, estas características también se han detectado, utilizando técnicas de alta sensibilidad, en tejidos no neoplásicos de individuos con CMMRD y en tejidos diana (colon, endometrio) de individuos con SL.

Nuestra hipótesis principal es que el desarrollo y validación de técnicas altamente sensibles pueden mejorar el diagnóstico y manejo clínico de los individuos con estos síndromes. El objetivo principal de esta tesis es evaluar la utilidad clínica de las técnicas moleculares de alta sensibilidad en el manejo clínico de individuos con síndromes asociados a deficiencia de reparación de errores de apareamiento. Los objetivos específicos son: i) evaluar la utilidad del análisis de metilación de MLH1 con alta sensibilidad para la identificación de individuos con mosaicismo epigenético en MLH1 como posible causa de SL; ii) validar la utilidad clínica de la aproximación hs-MSI en el diagnóstico de CMMRD y desarrollar nuevas estrategias con una mejor relación coste-efectividad y iii) evaluar la utilidad clínica del análisis hs-MSI en el seguimiento ginecológico en mujeres con SL.

La utilización de la técnica MS-MCA para la evaluación de metilación en MLH1 con alta sensibilidad, ha permitido la identificación de un paciente con mosaicismo epigenético en baja proporción. Además, hemos validado que la técnica de diseño propio hs-MSI para detección de MSI con alta sensibilidad es útil como ensayo complementario en el diagnóstico de CMMRD, a la vez que permite caracterizar patrones de MSI en los tumores asociados. Este ensayo también tendría la capacidad de identificar aquellos individuos con CMMRD causado por mutaciones en PMS2 en muestras de sangre o tumor. Asimismo, hemos desarrollado una segunda generación de la técnica, el ensayo hs-MSI32, que ha demostrado ser más coste-efectiva e igualmente precisa y que será de utilidad para el cribado poblacional de individuos con sospecha de CMMRD.

Finalmente, hemos identificado niveles de hs-MSI elevados en aspirados de mujeres con SL que han desarrollado cáncer de endometrio o lesiones preneoplásicas. También hemos observado niveles elevados de hs-MSI en el endometrio morfológicamente normal, cuyos niveles correlacionan con la pérdida de expresión de las proteínas MMR. Las métricas derivadas de hs-MSI (score y clonalidad), junto con el análisis de expresión de proteínas MMR en muestras de aspirado endometrial obtenidas durante el seguimiento de mujeres con SL, complementa el diagnóstico histopatológico incrementando el número de pacientes diagnosticadas de manera correcta. El elevado valor predictivo negativo de hs-MSI permitiría identificar aquellas pacientes con bajo riesgo de progresión neoplásica. Asimismo, la técnica hs-MSI aplicada a muestras ginecológicas mínimamente invasivas ha demostrado una alta sensibilidad y especificidad para la detección de CE, lo que permitirá su uso como estrategia mínimamente invasiva en el seguimiento ginecológico de mujeres con SL.

En conclusión, el desarrollo y validación de técnicas moleculares de alta sensibilidad (MS-MCA, hs-MSI, y hs-MSI32) ha demostrado ser de utilidad para mejorar la identificación de individuos con mosaicismo epigenético en MLH1 e individuos con CMMRD. Asimismo, el análisis de muestras ginecológicas mediante hs-MSI abre la puerta a su potencial uso en el seguimiento ginecológico de mujeres con SL ya que incrementa el rendimiento y facilita su aceptabilidad.

[eng] Constitutional pathogenic variants and epimutations in mismatch repair (MMR) genes (MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2) are responsible for hereditary cancer predisposition syndromes associated with MMR deficiency: Lynch syndrome (LS), caused by monoallelic (epi)mutations, and Constitutional Mismatch Repair Deficiency (CMMRD), caused by biallelic inactivation. MMR mutation carriers are characterized by the development of a broad spectrum of tumors, characterized by MMR loss of expression and microsatellite instability (MSI). Recently, these features have also been detected in non-neoplastic tissues of CMMRD and target tissues in LS individuals by means of highly sensitive techniques. The main aim of this dissertation is to evaluate the usefulness of highly sensitive molecular techniques in the clinical management of individuals with MMR-deficiency associated cancer syndromes.

Our work allowed the identification of a patient exhibiting epigenetic mosaicism in low proportion by means of MS-MCA technique, which assesses MLH1 methylation at high sensitivity. Furthermore, we have successfully validated the hs-MSI (highly sensitive MSI) assay as a useful ancillary test for CMMRD diagnosis, which also allows characterization of MSI patterns in associated tumors, being able to pinpoint those individuals with CMMRD secondary to PMS2 mutations. Moreover, the new assay hs-MSI32 has demonstrated higher cost-effectiveness and equivalent accuracy, providing a tool for CMMRD population screening. Finally, we have demonstrated that the evaluation of MSI at high sensitivity, combined with the analysis of MMR protein expression in endometrial aspirate samples, complements the histopathologic analysis by increasing the number of LS patients correctly diagnosed. Likewise, the hs-MSI assay in minimally invasive gynecologic samples has exhibited high levels of sensitivity and specificity for endometrial cancer detection in these patients.

In conclusion, the development and validation of highly sensitive molecular techniques (MSMCA, hs-MSI, and hs-MSI32) has proven useful for the identification of individuals with epigenetic mosaicism in MLH1 and CMMRD. Likewise, the assessment of gynecological samples by hs-MSI may facilitate and improve the gynecological follow-up of Lynch syndrome women.