Implementació i desenvolupament d'estudis funcionals per demostrar la patogenicitat de variants de significat incert i identificar nous gens causants de malaltia

Abstract

[cat] Les malalties metabòliques hereditàries (MMH) són un grup de patologies amb una gran heterogeneïtat clínica, bioquímica i genètica. Actualment se n’han descrit més de 1 800. En l’última dècada la implementació de les tècniques de seqüenciació massiva (seqüenciació de l’exoma complet, WES i seqüenciació del genoma complet, WGS) ha permès identificar la causa genètica de la malaltia en un gran nombre de pacients i descobrir un nombre important de nous gens associats a patologia. Malgrat això, aproximadament la meitat dels pacients roman sense rebre un diagnòstic genètic definitiu. Això es deu, en part, a limitacions tècniques pel que fa a la detecció i priorització de variants candidates, així com a l gran nombre de variants de significat incert (VUS) que s’identifiquen. Per aquests motius cal desenvolupar aproximacions addicionals que ajudin a prioritzar i interpretar l’impacte funcional de les variants identificades per poder-ne determinar la seva patogenicitat. En el context d’aquesta tesi doctoral, hem aplicat una estratègia multiòmica, basada en la combinació de WES/WGS amb la seqüenciació de l’RNA (RNA seq)seq), en una cohort de 65 pacients amb sospita de MMH. L’estratègia utilitzada ha permès orientar el diagnòstic i identificar gens causants de malaltia en un gran nombre de pacients. No obstant això, en molts casos s’ha requerit la realització d’estudis funcionals , la contribució dels quals ha estat essencial per demostrar l’impacte de les variants prioritzades i assolir un diagnòstic genètic definitiu. En concret, la tesi doctoral inclou cinc publicacions originals , quatre de les quals es centr en la caracterització funcional de noves variants genètiques en quatre gens implicats en funcions molt diverses : CCDC186 , PEX1 , PTCD3 i TFRC . En el primer treball hem identificat tres pacients amb variants en CCDC186 i confirmem que aquestes s’associen a un trastorn que presenta una característica combinació d’alteracions endocrines i del sistema nerviós central. En el segon article hem aplicat la combinació de WES, RNA seq i estudis funcionals per acabar amb l’odissea diagnòstica de més 30 anys en una pacient amb deficiència de PEX1 . En el tercer treball hem descrit tres pacients amb variants en PTCD3 , que codifica per una proteïna associada al ribosoma mitocondrial , la disfunció de la qual provoca un trastorn del metabolisme energètic mitocondrial. A més, hem consolidat que les variants en aquest gen s’associen amb l a síndrome de Leigh. En el quart treball hem descrit per primer cop que diferents variants en TFRC poden associar-se a diverses presentacions clíniques: immunodeficiència combinada, anèmia microcítica o cardiomiopatia hipertròfica. Estudis funcionals realitzats en models cel·lulars modificats genèticament mitjançant CRISPR/Cas9 han ampliat les bases fisiopatològiques de la deficiència de TFRC , tot mostrant que, en diferent mesura, les variants identificades en els pacients afecten la viabilitat cel·lular, l a regulació de l’autofàgia i l’homeòstasi del ferro i provoquen una alteració generalitzada de la funció mitocondrial. La cinquena publicació ha consistit en el desenvolupament d’un flux de treball basat en el sistema d’edició genètica CRISPR/Cas9 en cèl·lules HAP1 . L’estratègia proposada permet introduir les variants genètiques identificades en pacients i generar models cel·lulars models cel·lulars knockin per tal d’investigar les seves conseqüències funcionals. . En conclusió, aquesta tesi doctoral emfatitza la importància d’implementar els estudis de validació funcional, així com altres aproximacions òmiques més enllà del WES/WGS al flux diagnòstic de les malalties minoritàries. En aquest sentit, la incorporació de l’RNAl’RNA-seq ha contribuït de forma important al diagnòstic gràcies a la identificació de variants causants de patologia no prioritzades pel WES, així com generant evidències funcionals de l’impacte d’aquelles variants que afecten generant el processament del mRNA.. A més, els estudis funcionals realitzats en material biològic dels pacients o en models cel·lulars modificats genèticament han contribuït en avaluar l’impacte de les variants identificades, tot ajudant a dirigir el diagnòstic i en alguns casos a la presa de decisions decisions clíniques.