Mouse model of fetal alcohol spectrum disorders according to two human alcohol drinking patterns and the role of epigallocatechin gallate in their prevention. Epigallocatechin gallate bioavailability study in humans

Abstract

[eng] HYPOTHESIS: Prenatal alcohol exposure produces different degrees of fetal growth restriction, placental disorders, and brain impairments in humans depending on the type of exposure (acute or binge versus chronic moderate or Mediterranean). EGCG therapy administered under optimal pharmacokinetic conditions may attenuate these abnormalities. The specific hypotheses of this doctoral thesis are: 1. Binge human-like pattern of PAE produces more severe fetal growth restriction and placental disorders than Mediterranean PAE 2. Binge human-like pattern of PAE produces more severe brain impairment in comparison to Mediterranean PAE 3. EGCG therapy administered under optimal pharmacokinetic conditions may mitigate placental and brain alterations produced by PAE according to the two human-like drinking patterns (binge versus Mediterranean) 4. Highest plasma concentrations are reached with oral EGCG administration without food supplements 5. Food supplements improve the stability of oral EGCG administration. OBJECTIVES: The main objectives of this thesis are to evaluate the protective effect of EGCG on a FASD-like mouse model exposed to two human-like drinking patterns (acute or binge versus chronic moderate or Mediterranean) and assess the specific EGCG bioavailability profile in humans under different nutritional conditions. The specific objectives of this doctoral thesis are: 1. To assess the effects of binge versus Mediterranean alcohol exposure on fetal growth and placenta, based on fetal and placental weight and placental angiogenesis biomarkers 2. To analyze the effects of binge versus Mediterranean alcohol exposure on maturation, differentiation, and plasticity in fetal brain processes based on specific neuronal biomarkers 3. To study the protective effect of EGCG on fetal growth, placental development, and neurogenesis processes 4. To analyze the bioavailability of oral EGCG administered alone or with different food supplements in healthy volunteers 5. To evaluate the pharmacokinetic parameters of EGCG in healthy volunteers.

[spa] INTRODUCCIÓN: Según la Organización Mundial de la Salud, la exposición prenatal a alcohol es la principal causa evitable de discapacidad intelectual en el mundo occidental, asociándose a diferentes alteraciones físicas y desórdenes neurológicos que conllevan alteraciones cognitivas y conductuales. El conjunto de estas alteraciones se denominan trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF). Los desórdenes relacionados con esta exposición a alcohol se asocian a importantes problemas en la esfera social y conlleva una serie de costes para el sistema de salud pública. Aunque el consumo del alcohol de forma aguda y compulsiva es el patrón de consumo más habitual, otros tipos de consumo, como el Mediterráneo (bajas dosis de forma continuada), son habituales en determinadas zonas geográficas. Sin embargo, se desconocen actualmente los mecanismos responsables de la toxicidad del alcohol. Los roedores como la cepa de ratón C57BL/6 permiten evaluar los efectos teratogénicos del alcohol según la dosis y el momento del desarrollo en que se administra, analizando comportamientos complejos similares a los humanos y terapias experimentales prometedoras. Las similitudes en las etapas del desarrollo neurológico en los ratones y humanos permiten llevar a cabo estos estudios, pero hay que tener en cuenta que en el ratón el equivalente al tercer trimestre de gestación humana ocurre en la etapa postnatal. La dismorfología facial debida a la exposición prenatal a alcohol aparece durante el equivalente al primer trimestre de gestación humana, pero el desarrollo neurológico ocurre continuamente durante toda la gestación, por lo que el consumo en cualquier momento del embarazo puede conducir a alteraciones en procesos claves como la proliferación, la migración, la diferenciación, la sinaptogénesis, la gliogénesis, la mielinización y la apoptosis en los linajes neuronales, que conllevan alteraciones neurológicas y del comportamiento. Por otro lado, el consumo prenatal de alcohol produce deficiencias nutricionales maternas y alteraciones en la angiogénesis e histología placentaria que conllevan a una restricción del crecimiento fetal. Actualmente no disponemos de ningún tratamiento específico para el TEAF, a parte del diagnóstico precoz y el tratamiento de los síntomas. La epigalocatequina galato (EGCG) es un flavonoide con poder antioxidante que se ha evaluado en el tratamiento de diversas patologías humanas. Dado que el alcohol produce un aumento de estrés oxidativo, la EGCG se plantea como una opción terapéutica para el TEAF. Algunos estudios han demostrado que la EGCG se puede distribuir en el cerebro embrionario y fetal mediante su administración a la gestante, pero es necesario conocer mejor su perfil farmacocinético. Actualmente no existe consenso sobre la concentración más adecuada de EGCG para obtener unos efectos terapéuticos óptimos. Conocer bien el perfil farmacocinético de la EGCG puede ser útil con el fin de utilizarlo en futuros ensayos clínicos. HIPÓTESIS: La exposición prenatal a alcohol produce diferente grado de restricción de crecimiento fetal, trastornos placentarios y desórdenes neurológicos según el patrón de consumo humano (agudo o binge versus moderado crónico o Mediterráneo). La terapia con EGCG administrada en las condiciones farmacocinéticas óptimas puede atenuar estas anomalías. OBJETIVOS: Los objetivos principales de esta tesis doctoral son evaluar el efecto protector de la terapia con EGCG en un modelo de TEAF en ratón de acuerdo con los dos patrones de consumo humano (agudo o binge versus moderado crónico o Mediterráneo), y analizar el perfil de biodisponibilidad específico de la EGCG en humanos bajo diferentes condiciones nutricionales. MÉTODOS: Para llevar a cabo los objetivos de esta tesis se realizó un estudio preclínico en modelo de ratón y un estudio prospectivo cruzado en humanos. En el estudio preclínico se utilizó la cepa de ratón C57BL/6. Se realizaron los apareamientos y el diagnóstico de gestación se llevó a cabo mediante la visualización de tapón espermático. Las ratonas gestantes fueron asignados aleatoriamente a 6 grupos experimentales: (1) control Mediterráneo (1,38 mg/kg maltodextrina); (2) etanol Mediterráneo (0,75 mg/kg etanol); (3) etanol Mediterráneo + antioxidante (0,75 mg/kg etanol + 30 mg/kg EGCG); (4) control binge (5,52 mg/kg maltodextrina); (4) etanol binge (3 mg/kg etanol); (6) etanol binge + EGCG (0,75 mg/kg etanol + 30 mg/kg EGCG). Las gestaciones se finalizaron mediante cesáreas el día 19 y se realizaron necropsias con obtención de placenta y tejido cerebral. Se analizó el crecimiento fetal, se realizó estudio de los fenómenos de angiogénesis en placenta (VEGF-A, PLGF y VEGF-R), del estrés oxidativo (Nrf2), y los procesos del desarrollo neurológico que incluyen la maduración (NeuN, DCX), diferenciación (GFAP) y plasticidad neuronal (BDNF) mediante técnicas de Western blot e inmunohistoquímica. Por último, se realizaron los análisis estadísticos correspondientes. En el estudio cruzado, se reclutaron prospectivamente diez voluntarios sanos (cinco mujeres y cinco hombres). Se realizaron tres series de experimentos clínicos con un período de descanso de siete días entre cada uno: (1) Teavigo® (extracto de EGCG) en ayunas; (2) Teavigo® con un desayuno estándar; y (3) FontUp® (Teavigo® en un preparado comercial con suplementos nutricionales). Se realizaron extracciones de sangre en los minutos 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240 y 360 después de la administración de EGCG. La determinación de EGCG en plasma se realizó mediante el método analítico de cromatografía y espectrometría de masas UPLC-ESI-MS/MS. Se analizaron estadísticamente las siguientes variables farmacocinéticas: AUC0-360, Cmax, Cav, Cmin, T1/2 y Tmax. RESULTADOS PRINCIPALES: Respecto al estudio en el modelo animal objetivamos que cualquier patrón de consumo de alcohol (Mediterráneo o binge) produce efectos no deseados en la descendencia. Con la administración de dosis elevadas de alcohol encontramos una restricción de crecimiento fetal importante, sin embargo, las dosis más moderadas no fueron suficientes para sobrepasar el umbral requerido para que se produjera un déficit de crecimiento. Cualquier patrón de consumo produjo desequilibrios en la expresión de los factores angiogénicos en placenta (VEGF-A, VEGF-R) y desórdenes en los procesos del desarrollo neuronal, incluyendo la pérdida de neuronas maduras (NeuN), retraso en la maduración neuronal (DCX) y desórdenes en la diferenciación astrocitaria (GFAP). La exposición a alcohol continuada durante el desarrollo fetal puede conducir a una habituación en determinados procesos como la plasticidad neuronal (BDNF). El tratamiento con EGCG fue capaz de revertir las alteraciones del crecimiento fetal y desarrollo placentario, el estrés oxidativo, y los desórdenes en los procesos del desarrollo neurológico fetal. En el estudio cruzado para el análisis de la biodisponibilidad de la EGCG, con la administración de Teavigo® en ayunas se obtuvieron concentraciones más elevadas en plasma (evaluadas mediante AUC0-360, Cmax y Cav), tanto en hombres como en mujeres. Sin embargo, la variabilidad interindividual fue menor (T1/2 más elevada) con la administración de Teavigo® con un desayuno estándar y principalmente con el suplemento alimenticio FontUp®. CONCLUSIONES: Los resultados presentados en esta tesis apoyan el uso de la EGCG como un potencial tratamiento prenatal para las alteraciones en los procesos neuronales fetales, el desarrollo placentario y el crecimiento fetal producidas por la exposición prenatal a alcohol. Estos hallazgos suponen el punto de partida para plantear nuevas investigaciones sobre el efecto de la EGCG sobre los trastornos del comportamiento relacionados con el TEAF en el adulto. El conocimiento sobre las características farmacocinéticas de la EGCG permitirá su uso en la población gestante humana como una alternativa segura para el tratamiento de los problemas de salud derivados del consumo prenatal de alcohol.