Pathophysiological understanding of acute decompensated heart failure: a proteomic approach

Abstract

[eng] INTRODUCTION: Heart failure is a dynamic pathological condition that frequently presents episodes of acute worsening, recognised as acute decompensated heart failure (ADHF). This is a complex clinical condition that may affect different organs and involve several pathophysiological mechanisms that remain incompletely understood. ADHF is often related to kidney dysfunction, which impacts disease evolution resulting in higher risk for adverse outcomes. It is our hypothesis that identification and better characterisation by proteomic approaches of proteins associated with heart failure decompensation would contribute to gain understanding of the disease pathophysiology, support a more accurate disease phenotyping, and better identify patients with poor disease evolution. OBJECTIVES: The aim of this thesis was to identify and characterise the differential protein signature in urine of ADHF patients in association with molecular functions and biological processes related to disease progression. METHODS: ADHF patients admitted to the emergency room at Hospital de la Santa Creu i Sant Pau were included in the study. Urine samples were analysed by an untargeted mass spectrometry approach and compared with a group of healthy subjects by 2 dimensional electrophoresis coupled to mass spectrometry (MALDI-ToF/ToF). In silico analysis was performed and proteins selected for further validation studies using specific immunoassays (ELISA), in urine and plasma/serum samples. ADHF comparison groups were defined by the glomerular filtration rate and left ventricular ejection fraction (LVEF). Healthy subjects were used to determine the normal range. Protein

power to discriminate ADHF patients according to their pathology, disease severity, and prognosis was achieved by Receiver operating curve (ROC) and Kaplan-Meier survival curve analysis. Cell function mechanistic studies were also performed. RESULTS: A differential signature of 26 proteins (more than 1.5 fold), mostly of hepatic origin, was identified. These proteins relate to molecular functions and processes, such as transport, haemostasis, and immunity. Of note, we observed elevated levels in urine at hospital admission of transthyretin (TTR), antithrombin III (AT3), complement C3 (C3) and vitamin D binding protein (VDBP) when compared to HS. The increased urinary loss of proteins, such as TTR and retinol binding protein 4 (RBP4) may have a harmful impact on disease evolution resulting in higher risk for adverse outcomes after hospital discharge. Furthermore, high AT3 levels in urine and plasma identified those ADHF patients with renal dysfunction and preserved and mildly reduced LVEF. AT3, beyond its role in coagulation, correlates with C3, a key component of innate immunity, independently of systemic inflammation. Interestingly, C3 is localised in vascular extracellular matrix and stimulates cell functions such as adhesion, migration and cytoskeletal reorganisation. Levels of VDBP, along with cystatin C and KIM-1, could help to stratify ADHF patients at higher risk of developing kidney injury during hospitalisation. IN CONCLUSION, the results of this thesis show a urinary protein signature in ADHF patients highly diverse yet different from healthy individuals. The obtained results suggested a harmful impact of the differential protein signature on disease evolution resulting in a higher risk for adverse outcomes after hospital discharge. Future studies in larger populations are needed to validate the relevance of the identified differential protein signature in ADHF pathophysiology.

[cat] INTRODUCCIÓ: La insuficiència cardíaca és una condició patològica dinàmica que presenta freqüentment episodis aguts d’empitjorament, coneguts com insuficiència cardíaca aguda descompensada (acute decompensated heart failure, ADHF, per les seves sigles en anglès). Es tracta d’una síndrome clínica complexa que pot afectar diversos òrgans i que involucra diferents mecanismes fisiopatològics, els efectes dels quals no es coneixen completament. L’ADHF està relacionada amb la disfunció renal, la qual afecta l’evolució de la malaltia i dona lloc a un major risc de complicacions. La nostra hipòtesi és que la identificació i una millor caracterització, mitjançant un enfocament proteòmic, de les proteïnes associades amb la descompensació aguda de la insuficiència cardíaca contribuiria a comprendre la fisiopatologia de la malaltia, aportaria un fenotip més precís i permetria identificar millor els pacients amb una pitjor evolució de la malaltia. OBJECTIUS: L’objectiu d’aquesta tesi va ser identificar i caracteritzar la signatura proteica diferencial a l’orina de pacients amb ADHF en associació amb funcions moleculars i processos biològics relacionats amb la progressió de la malaltia. MÈTODES: A l’estudi s'hi van incloure pacients admesos a l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Les mostres d’orina es van analitzar mitjançant un enfocament no dirigit d’espectrometria de masses, i es van comparar amb les d'un grup d’individus sans a través d’electroforesi bidimensional acoblada a espectrometria de masses (MALDI-ToF/ToF). Es van realitzar anàlisis in silico i es van seleccionar proteïnes per a estudis de validació posteriors mitjançant immunoassaigs específics (ELISA), en mostres d’orina i plasma/sèrum. Els grups de comparació

d’ADHF es van definir per la filtració glomerular i la fracció d’ejecció del ventricle esquerre (FEVE). Es va utilitzar un grup d’individus sans per determinar el rang normal. La capacitat de les proteïnes per identificar els pacients ADHF segons la seva patologia, severitat de la malaltia i pronòstic es va obtenir mitjançant l’anàlisi de la corba característica operativa del receptor (ROC curve en anglès) i l’anàlisi de corba de supervivència de Kaplan-Meier. També es van realitzar estudis de mecanismes de la funció cel·lular. RESULTATS: La signatura diferencial va mostrar 26 proteïnes (amb canvis de més d'1.5 vegades), la majoria d’origen hepàtic. Aquestes proteïnes estan associades a funcions i processos moleculars, com ara el transport, l’hemostàsia i la immunitat. Cal destacar que es van observar nivells elevats a l’orina de l’ingrés hospitalari de transtiretina (TTR), antitrombina III (AT3), complement C3 (C3) i la proteïna transportadora de la vitamina D (VDBP) en comparació amb individus sans. Els nivells elevats de pèrdua en orina de proteïnes com la TTR i la proteïna d’unió al retinol 4 (retinol binding protein 4, RBP4, en anglès) podrien tenir un impacte perjudicial en l’evolució de la malaltia, donant lloc a un elevat risc de complicacions. A més, els nivells elevats d’AT3 a l’orina i al plasma van permetre identificar els pacients amb ADHF amb disfunció renal i FEVE conservada o lleugerament reduïda. Més enllà del seu paper en la coagulació, l’AT3 es correlaciona amb C3, un dels principals components de la immunitat innata, independentment de la inflamació sistèmica. Curiosament, C3 es localitza a la matriu extracel·lular vascular i estimula funcions cel·lulars com l’adhesió, la migració i la reorganització del citoesquelet. Els nivells de VDBP, juntament amb els de cistatina C i KIM-1 (kidney injury molecule 1 en anglès), podrien ajudar a estratificar els pacients d'ADHF amb major risc de desenvolupar dany renal durant l’hospitalització.

EN CONCLUSIÓ, els resultats d’aquesta tesi mostren una signatura de proteïnes en orina en pacients d'ADHF molt diversa però, a la vegada, diferent a la d’individus sans. Els resultats obtinguts suggereixen un impacte perjudicial de la signatura diferencial de proteïnes en l’evolució de la malaltia, donant lloc a un major risc de complicacions després de l’alta hospitalària. Són necessaris més estudis en poblacions més grans per validar la rellevància de la signatura de proteïnes diferencials identificada en la fisiopatologia de l’ADHF.

[spa] INTRODUCCIÓN: La insuficiencia cardíaca es una condición patológica dinámica que presenta frecuentemente episodios agudos de empeoramiento, conocidos como insuficiencia cardíaca aguda descompensada (acute decompensated heart failure, ADHF, por sus siglas en inglés). Se trata de un síndrome clínico complejo que puede afectar varios órganos y que involucra distintos mecanismos fisiopatológicos, cuyos efectos permanecen poco conocidos. El ADHF está relacionado con la disfunción renal, la cual afecta la evolución de la enfermedad y da lugar a un mayor riesgo de complicaciones. Nuestra hipótesis es que la identificación y una mejor caracterización, mediante un enfoque proteómico, de las proteínas asociadas con la descompensación aguda de la insuficiencia cardíaca contribuiría a comprender la fisiopatología de la enfermedad, aportaría un fenotipo más preciso y permitiría identificar mejor los pacientes con una peor evolución de la enfermedad. OBJETIVOS: El objetivo de esta tesis fue identificar y caracterizar la signatura proteica diferencial en orina de pacientes con ADHF en asociación con funciones moleculares y procesos biológicos relacionados con la progresión de la enfermedad. MÉTODOS: En el estudio se incluyeron pacientes admitidos en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Las muestras de orina se analizaron mediante un enfoque no dirigido de espectrometría de masas, y se compararon con las de un grupo de individuos sanos a través de electroforesis bidimensional acoplada a espectrometría de masas (MALDIToF/ToF). Se realizaron análisis in silico y se seleccionaron proteínas para estudios de validación posteriores mediante inmunoensayos específicos (ELISA), en muestras de orina y plasma/suero. Los grupos de comparación de ADHF fueron definidos por la filtración glomerular y la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI). Se usó un grupo de individuos sanos para determinar el rango normal. La capacidad de las proteínas para identificar a los pacientes ADHF según su patología, severidad de la enfermedad y pronóstico se obtuvo mediante el análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC curve en inglés) y el análisis de la curva de supervivencia de Kaplan-Meier. También se realizaron estudios de mecanismos de la función celular.

RESULTADOS: La signatura diferencial mostró 26 proteínas (con cambios de más de 1.5 veces), la mayoría de origen hepático. Estas proteínas están asociadas a funciones y procesos moleculares, como el transporte, la hemostasia y la inmunidad. Cabe destacar que se observaron niveles elevados en orina del ingreso hospitalario de transtiretina (TTR), antitrombina III (AT3), complemento C3 (C3) y la proteína transportadora de la vitamina D (VDBP) en comparación con individuos sanos. Los niveles elevados de pérdida en orina de proteínas como la TTR y la proteína de unión al retinol 4 (retinol binding protein 4, RBP4, en inglés) podrían tener un impacto perjudicial en la evolución de la enfermedad, dando lugar a un mayor riesgo de complicaciones. Además, los niveles elevados de AT3 e orina y en el plasma permitieron identificar a los pacientes con ADHF con disfunción renal y FEVI conservada/ligeramente reducida. Más allá de su papel en la coagulación, la AT3 se correlaciona con C3, uno de los principales componentes de la inmunidad innata, independientemente de la inflamación sistémica. Curiosamente, el C3 se localiza en la matriz extracelular vascular y estimula funciones celulares como la adhesión, la migración y la reorganización del citoesqueleto. Los niveles de VDBP, juntamente con los de cistatina C y KIM-1 (kidney injury molecule 1 en inglés), podrían ayudar a estratificar los pacientes ADHF con mayor riesgo de desarrollar daño renal durante la hospitalización. EN CONCLUSIÓN, los resultados de esta tesis muestran una signatura de proteínas en orina en pacientes ADHF muy variada, pero, a la vegada, distinta a la de individuos sanos. Los resultados obtenidos sugieren un impacto perjudicial de la signatura diferencial de proteínas en la evolución de la enfermedad, dando lugar a un mayor riesgo de complicaciones después del alta hospitalaria. Son necesario más estudios en poblaciones mayores para validar la relevancia de la signatura de proteínas diferenciales identificada en la fisiopatología de ADHF.