Human pluripotent stem cells: towards the definition of new engineering approaches to target heart and kidney disease

Abstract

[eng] Human pluripotent stem cells (hPSCs) offer a significant advantage in recapitulating key features related to tissue differentiation, morphogenesis and, conversely, human diseases. Taking advantage of their inherent ability to differentiate into the three germ layers, and their unlimited self-renewal capacity, the field has been able to establish novel methodologies to generate three dimensional (3D) self-organized organ-like structures, known as organoids. Moreover, the discovery and development of CRISPR/Cas9 technology has revolutionized our ability to introduce permanent or transient changes in the genome of living organisms and cells. In this context, the host laboratory has previously developed a cellular platform, called iCRISPR2 (iC2), which utilizes an inducible Cas9 under the endogenous TET/ON promoter to enable the efficient genome editing of hPSCs. The iC2 system allows the generation of reporter, knock-out and knock-in hPSC lines. In the present thesis, we have established new tools and methodologies to generate hPSC-derived cardiac models both in two- dimensional (2D) and three-dimensional (3D) culture conditions. To this aim, by exploiting the iC2 platform, we have first generated and characterized hPSC cardiac reporter lines mirroring the endogenous expression of MYH6, MYL2, and SIRPA. Following a well-established cardiac differentiation procedure developed previously in the host laboratory, we have demonstrated the efficient generation of beating cardiac- like cells from these reporter lines in 2D culture conditions. Leveraging this new tool, we have defined a novel approach to generate 3D cardiac-like organoids in a robust and efficient manner that exhibit relevant cardiac differentiation and functional characteristics. Building on the newly defined cardiac-like organoids, we have directed our attention toward establishing a new cardiac in vitro model that can emulate important aspects of diabetic cardiomyopathy. For this purpose, we have investigated the impact of exposing hPSC-derived cardiac-like organoids to a diabetic-like insult that was previously reported by the host laboratory to induce early hallmarks of diabetic-like disease in hPSC-derived kidney organoids. Cardiac-like organoids exposed to diabetic-like culture conditions compared to normoglycemia were interrogated at the morphological, transcriptional, and functional levels to assess on the potential phenotypic alterations associated to early hallmarks of diabetic cardiopathy. Furthermore, in the last part of the present thesis, we have focused our efforts on combining hPSC-derived organoid technology with bioengineering to develop new approaches to enhance the differentiation and functional maturation of hPSC-derived organoids. To this end, we have established novel procedures based on organ decellularization technology to fabricate biomaterials mimicking the biochemical composition of the native organ. We have derived biomimetic hydrogels from decellularized extracellular matrices (dECM) obtained from kidney and heart that have been applied as new cell culture biomaterials during the differentiation of hPSC- derived kidney and cardiac organoid models. All in all, by harnessing the power of organoid technology and pioneering the development of novel biomaterials, we have successfully established advanced hPSC-derived biomodels serving as valuable tools for conducting promising investigations for future advancements in regenerative medicine applications. In view of the current advances in the field of hPSC-derived organoids, genome engineering and bioengineering, in the present thesis, we further discuss the major achievements and ongoing challenges in the development of cardiac and kidney organoids as human in vitro models to study organ development and disease.

[spa] Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) ofrecen una ventaja significativa al recapitular características clave relacionadas con la diferenciación de tejidos, la morfogénesis y las enfermedades humanas. Aprovechando su capacidad intrínseca de diferenciarse en las tres capas germinales y su capacidad de autorrenovación ilimitada, el campo ha logrado establecer nuevas metodologías para generar estructuras tridimensionales (3D) auto-organizadas similares a órganos, conocidas como organoides. Además, el descubrimiento y desarrollo de la tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado nuestra capacidad para introducir cambios permanentes o transitorios en el genoma de organismos y células vivas. En este contexto, el laboratorio anfitrión ha desarrollado previamente una plataforma celular llamada iCRISPR2 (iC2), que utiliza un Cas9 inducible bajo el promotor endógeno TET/ON para permitir la edición eficiente del genoma de las hPSC. El sistema iC2 permite generar líneas hPSC reporteras, knock-out y knock-in. En la presente tesis, hemos establecido nuevas herramientas y metodologías para generar modelos cardiacos derivados de hPSC tanto en condiciones de cultivo bidimensionales (2D) como tridimensionales (3D). Con este fin, utilizando la plataforma iC2, primero hemos generado y caracterizado líneas de células cardiacas hPSC que reflejan la expresión endógena de MYH6, MYL2 y SIRPA. Siguiendo un procedimiento bien establecido de diferenciación cardiaca desarrollado previamente en el laboratorio anfitrión, hemos demostrado la generación eficiente de células similares a cardiomiocitos en condiciones de cultivo 2D a partir de estas líneas reporteras. Aprovechando esta nueva herramienta, hemos definido un enfoque novedoso para generar organoides similares al corazón en 3D de manera robusta y eficiente, que exhiben características relevantes de diferenciación y funcionalidad cardiacas. Basándonos en los organoides cardiacos recién definidos, hemos dirigido nuestra atención hacia el establecimiento de un nuevo modelo in vitro para el corazón que pueda emular aspectos importantes de la cardiomiopatía diabética. Con este propósito, hemos investigado el impacto de exponer los organoides cardiacos derivados de hPSC a una agresión similar a la diabética, que previamente había sido reportada por el laboratorio anfitrión por inducir marcadores tempranos de enfermedad similar a la diabética en organoides renales derivados de hPSC. Los organoides cardiacos expuestos a condiciones de cultivo similares a la diabética, en comparación con la normoglucemia, fueron analizados en cuanto a alteraciones morfológicas, transcripcionales y funcionales para evaluar los posibles cambios fenotípicos asociados con marcadores tempranos de cardiopatía diabética. Además, en la última parte de la presente tesis, hemos centrado nuestros esfuerzos en combinar la tecnología de organoides derivados de hPSC con la bioingeniería para desarrollar nuevos enfoques para mejorar la diferenciación y maduración funcional de los organoides derivados de hPSC. Con este fin, hemos establecido procedimientos innovadores basados en la tecnología de descelularización de órganos para fabricar biomateriales que imiten la composición bioquímica del órgano nativo. Hemos derivado hidrogeles biomiméticos a partir de matrices extracelulares descelularizadas (dECM) obtenidas del riñón y el corazón, que se han aplicado como nuevos biomateriales para el cultivo celular durante la diferenciación de los modelos de organoides cardiacos y renales derivados de hPSC. En resumen, aprovechando el poder de la tecnología de organoides y liderando el desarrollo de nuevos biomateriales, hemos establecido con éxito biomodelos avanzados derivados de hPSC que sirven como herramientas valiosas para llevar a cabo investigaciones prometedoras para futuros avances en aplicaciones de medicina regenerativa. A la luz de los avances actuales en el campo de los organoides derivados de hPSC, la ingeniería del genoma y la bioingeniería, en la presente tesis, también discutimos los principales logros y desafíos en curso en el desarrollo de organoides cardiacos y renales como modelos humanos in vitro para estudiar el desarrollo y las enfermedades de órganos.