Estudi del gen sonic HEDGEHOG (Shh) i dels gens de la família CEACAM durant l'embriogènesi del còlon humà i la seva implicació en el desenvolupament del càncer colorectal

Abstract

[cat] En aquest treball hem estudiat marcadors relacionats amb el desenvolupament embrionari del colon humà com són "Sonic hedgehog" i els membres de la família CEACAM comparant els seus nivells d'expressió en mostres de colon humà embrionari, teixit tumoral i teixit normal del propi pacient de pacients diagnosticats de càncer colorectal.

"Sonic hedgehog" (Shh) és un morfogen que s'expressa durant les etapes inicials de l'embriogènesi. Te un paper important en les primeres fases de l'organogènesi de cervell, pulmó, pàncrees i de l'aparell gastrointestinal. Shh també presenta expressió en molts tumors d'origen endodèrmic, però el seu paper en el desenvolupament del càncer colorectal no estava encara estudiat.

En el present treball hem realitzat un anàlisi morfològic de colons embrionaris , detecció per inmunohistoquímica i RT-qPCR per examinar l'expressió de Shh en colons d'entre 7 i 11 setmanes de desenvolupament així com també en teixit tumoral i normal del mateix pacient, de 63 pacients diagnosticats de càncer colorectal.

Els nostres resultats ens indiquen que l'expressió de Shh comença durant la setmana 7 de desenvolupament embrionari i es detecta a la zona de l'endoderma intestinal adjacent al mesènquima. Els nivells més elevats d'expressió de mRNA Shh es detecten a la setmana 9 de desenvolupament i mitjançant inmunohistoquímica, localitzem aquesta expressió tant a epiteli intestinal com a la zona del mesènquima.

Nivells baixos es detecten durant la setmana 11 de desenvolupament i, mitjançant inmunohistoquímica, aquesta expressió es detecta de manera lleu a la base de les criptes i en teixit muscular.

En colon humà embrionari, l'expressió de Shh és elevada en el moment de l'organització de l'endoderma embrionari (setmana 9) i l'expressió de Shh és baixa en el moment de la diferenciació del teixit del colon (setmana 11).

Mitjançant RT-qPCR veiem que els nivells de mRNA Shh en teixit tumoral són molt més elevats que els obtinguts en el cas del teixit normal (p=0.00001). Elevats nivells d'expressió s'associen amb estadis inicials (I-II) del desenvolupament d'un càncer colorectal (p=0.02).

Shh pot tenir un paper important tant en l'organització embrionària del colon humà com en les primeres etapes del desenvolupament d'un càncer colorectal.

Els membres de la família CEACAM (CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM67 i CEACAM8) són proteïnes de membrana que participen en processos d'immunitat i adhesió.Mitjançant RT-qPCR detectem expressió de CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6 i CEACAM7 en embrions d'entre 7 i 11 setmanes de desenvolupament. Els nivells de CEACAM6 van augmentant progressivament a mida que augmenta l'edat de l'embrió; és a dir, els seus nivells augmenten a mida que va augmentant el grau de diferenciació cel·lular de les cèl·lules que formen el colon humà embrionari. En el cas de l'anàlisi d'expressió de CEACAM5 observem que existeixen diferencies significatives entre els nivells d'expressió en teixit tumoral respecte al teixit normal (p=0.00008) i valors significatius respecte al temps a la progressió (p=0.001) i supervivència (p=0.006).

[eng] We have studied some markers related with colon development in human embryos, Shh and CEA family members, to compare their mRNA expression levels in human embryonary colon samples with adult tumor and matched normal tissue from patients affected by colorectal cancer. Sonic hedgehog (Shh) is a morphogene expressed during the early phases of embryogenesis and in the foregut development. It plays an important role in the organogenesis of the brain, lung, pancreas and gastrointestinal system. Shh is also expressed in several tumors of endodermic origin. In the present study, we used morphological analysis, real-time quantitative PCR, and immunohistochemical staining to examine Shh expression in the colon of human embryos of 7 to 11 weeks. Our results show that Shh begins to be expressed in the human colon at 7 weeks, when it is found only in the cells of the endodermal epithelium. The highest levels of Shh expression are observed at 9 weeks, in the endodermal epithelium and in the mesenchyme. At 11 weeks, the colon is morphologically differentiated, and only low levels of Shh expression are detected at the base of the colon crypts. We conclude that in the human embryonic colon, Shh is upregulated at the time of the greatest structural organization and downregulated when the colon has acquired greater morphological differentiation. We used real-time quantitative PCR to assess Shh mRNA expression levels in tumor and matched normal tissue from 57 colorectal cancer patients and correlated the results with patient clinicopathological characteristics. Shh expression levels were higher in tumor tissue than in normal tissue from the same patient (P=0.00001). Higher levels of Shh expression were associated with early stage disease (P=0.02). Shh overexpression may influence the development of colorectal cancer. CEA family members are membrane proteins involved in immunity and adhesion. Using RT-qPCR we have detected expression of CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7 in colon of human embryos between 7-11 weeks of development. mRNA CEACAM6 level increases progressively with embryonic age. CEACAM5 analysis show that high mRNA levels in tumor tissues compared with levels in normal tissues of the same patient are related with a low progression of the tumor and a higher survival.