Influència de les mutacions K-RAS en el fenotip angiogènic. K-RAS i neovasculació en carcinomes de còlon i recte: Efectes sobre la progressió tumoral i angiogènica de fibroblastes NIH3T3 transfectats amb mutacions K-RAS inoculades a diferents condicions.

Abstract

[cat] Una simple mutació en el gen K-Ras comporta transformació cel·lular. Les cèl·lules tenen pocs punts de transició que puguin determinar d'aquesta manera tan important el comportament cel·lular. Fins al punt que hi ha diferències entre diferents mutacions puntuals del mateix gen. Així va quedar demostrat que el creixement dels tumors subcutanis de NIH3T3 amb mutació en el codó 13 ( G:T - A:T/ Gly-Asp ASP13) tenen un període de latència més llarg però creixen més ràpid que els tumors NIH3T3 amb K-Ras mutat en el codó 12 (G:T - A:T/ Gly-Cys CYS12). En front a aquests resultats postulem que les mateixes mutacions puntuals en el gen K-Ras que determinen diferents fenotips de cèl·lules tumorals poden determinar diferències angiogèniques en els tumors que desenvolupen. Els marcatges específics amb anticossos de PECAM, desmina, α-Actina de la musculatura llisa i macròfags assenyalen que els tumors amb CYS12 tenen major densitat de vasos sanguinis però hem trobat diàmetres més grossos i més cèl·lules desmina positives al voltant dels vasos sanguinis dels tumors ASP13. La proliferació endotelial no ens aporta diferències entre els diferents tipus de tumors en un moment de creixement tumoral ja consolidat. Han estat analitzats els nivells de VEGF i els tumors amb mutació ASP13 expressen més aquest factor de creixement endotelial que no els tumors amb mutació CYS12. El fet de que in vitro també es denotin aquestes diferències ens remarca que la diferència mutacional en Ras és determinant. La presència d'altres cèl·lules de suport que hem descrit en els tumors ASP13 podria remarcar aquesta diferència però no de manera exclusiva. El VEGF que estan produint aquestes cèl·lules actua sobre les cèl·lules endotelials. Podem descartar l'efecte autocrí ja que no hem observat expressió ni estimulació del VEGFR2 in vitro. L'angiogènesi depent de la balança entre els factors pro i anti angiogènics. TSP-1, Ang 4 (precursor) i Ang-1 han estat analitzats en aquest sistema per Western Blot. L'expressió de TSP-1 en el sistema in vivo ha estat indetectable. En el cas de les angiopoietines observem una tendència dels tumors CYS12 acumular-ne més que els ASP13, però els resultats del Western Blot han estat molt heterogenis. L'absència de TSP-1 dóna força a les accions del VEGF en els tumors ASP13. Sembla que les angiopoietines podrien tenir un paper en el sitema angiogènic dels tumors CYS12. L'expressió de les MMPs ha estat analitzada per zimografia i Western Blot. In vitro no s'ha detectat expressió de MMP9 ni MMP7, d'aquesta manera queda palès que l'expressió d'aquestes metaloproteïnases la realitzen majoritàriament les cèl·lules acompanyants al tumor. Ja està descrit que els macròfags són grans productors de MMP9 i MMP7 i també que la seva expressió pot estar estimulada per citoquines, factors de creixement com el VEGF i molt induïda per l'hipòxia dels macròfags. Es relaciona aquestes dues MMPs amb proliferació i invasió cel·lular, promoció de l'apoptosi i alliberació de factors angiogènics entre altres possibles accions. Per tan afecten el fenotip vascular que hem descrit en els tumors ASP13. Els tumors amb mutació CYS12 incrementen la MMP2 activa respecte dels tumors ASP13 mentre que aquests segons tenen major expressió de TIMP-2 i MMP14 que els primers. La funció de promoure la migració endotelial que se li atribueix a la MMP2 podria explicar-nos la dispersió de les cèl·lules endotelials i el major número de vasos que observem en els tumors CYS12. TIMP-2 i MMP14 amb la capacitat de moderar la proliferació endotelial i d'estimular la tumoral respectivament poden contribuir a definir el fenotip angiogènic i tumoral dels tumors ASP13. Hem començat a traslladar aquests resultats en una sèrie de tumors colorectals humans on coneixem les mutacions en el gen K-Ras i disposem d'un seguiment clínic de més de 4 anys. No hem trobat diferències en la densitat vascular però si una tendència a expressar VEGFR2 en els tumors amb mutació en el gen K-Ras que comporta menys supervivència global. Aquests resultats confirmen que hi ha diferències angiogèniques entre diferents mutacions del gen K-Ras. Sembla que el VEGF, les metaloproteïnases i les cèl·lules de suport tumorals convergeixen a promoure aquestes diferències. En els tumors humans caldrà tenir més paràmetres per determinar si existeixen diferències.