Diferenciación adipocitaria y factores reguladores de la biogénesis mitocondrial. Efectos de los fármacos antiretrovirales.

Abstract

[spa] Los resultados presentados en esta Tesis se engloban en tres bloques de estudio: La implicación del adipocito marrón en la lipomatosis inducida por la terapia antiretroviral de elevada actividad (HAART), el estudio de nuevos factores reguladores de la función mitocondrial en el adipocito marrón y el efecto de los fármacos antiretrovirales en adipocitos en cultivo. El análisis de la expresión del gen marcador del adipocito marrón UCP-1 en varios lipomas de pacientes infectados con VIH y en terapia antiretroviral implica al adipocito marrón en la etiopatología de la lipomatosis asociada a la terapia HAART. El estudio de la regulación de la biogénesis mitocondrial a nivel molecular en adipocitos marrones, nos llevó a observar que la diferenciación del adipocito marrón va asociada a la inducción de los factores de transcripción mitocondrial B1 y B2 y el co-activador PGC-1-alfa, en asociación con una incrementada biogénesis mitocondrial. La expresión génica de estos factores es regulada de forma positiva por agonistas de PPAR-gamma e insulina. Por el contrario, la noradrenalina reprime la expresión de los factores de transcripción mitocondrial B1 y B2 por mecanismos dependientes de transcripción e independientes de síntesis proteica. Ello da lugar a una reducción en la expresión de genes codificados por el genoma mitocondrial como la subunidad II de la citocromo c oxidasa. Este efecto es dependiente del grado de diferenciación del adipocito marrón y se ve favorecido por la presencia de activadores de PPAR-gamma o insulina. La expresión del co-activador PGC-1-alfa se induce por noradrenalina, agonistas PPAR-gamma y agonistas RXR en adipocitos marrones diferenciados, pero no en preadipocitos. Dichas inducciones se dan por mecanismos independientes de síntesis proteica. La inducción de PGC-1-alfa por la noradrenalina se ve favorecida por la presencia de activadores PPAR-gamma. La inducción por agonistas PPAR-gamma y RXR se bloquea por un antagonista PPAR-gamma y es independiente de la activación de receptores adrenérgicos. Se describe, por tanto, una nueva vía de regulación PPAR-gamma/RXR-dependiente del gen PGC-1-alfa. Se estudió el efecto del litio, un fármaco utilizado en el tratamiento de la esquizofrenia y el trastorno bipolar, sobre la diferenciación del adipocito marrón. Se observó que el litio inhibe de forma dependiente del tiempo de exposición y de la dosis la diferenciación morfológica de adipocitos marrones en cultivo, así como la expresión de genes de expresión preferencial en al adipocito marrón. Estudiamos el efecto de los fármacos antiretrovirales inhibidores de la transcriptasa reversa sobre el adipocito marrón mediante el análisis de su diferenciación y expresión génica en relación con la función mitocondrial. Los resultados nos indicaron que los inhibidores de la transcriptasa reversa no-análogos de nucleósido tienen un efecto opuesto sobre la diferenciación del adipocito marrón: el efavirenz bloquea la acumulación de lípidos mientras que la nevirapina tiene un efecto positivo global sobre la diferenciación adipocitaria, biogénesis mitocondrial y expresión de UCP-1. Los inhibidores de la transcriptasa reversa análogos de nucleósidos no afectan la diferenciación del adipocito marrón. La estavudina, zidovudina y didanosina provocan una disminución en el contenido de mtDNA, aunque la expresión del genoma mitocondrial sólo se encuentra disminuida en las células tratadas con didanosina. La compensación a la depleción del mtDNA en las células con estavudina podría explicarse por el aumento en la expresión de los factores de transcripción mitocondrial. Además, la estavudina induce de manera específica la expresión génica de UCP-1 mediante mecanismos que implican la vía del ácido retinoico. Por último, desarrollamos un modelo celular de adipocitos humanos en cultivo primario y lo utilizamos en el análisis del efecto del fármaco antiretroviral didanosina. Los resultados nos mostraron que preadipocitos humanos en cultivo primario pueden diferenciarse a adipocitos con características morfológicas, de expresión génica y funcionales propias del adipocito blanco humano. La didanosina ejerce efectos compatibles con un bloqueo en la función mitocondrial.

[eng] The results presented in this Thesis have followed three main objectives: The implication of brown adipocytes in the highly active antiretroviral therapy- associated lipomatosis, the analysis of new regulatory factors of the mitochondrial function in the brown adipocyte and the study of the effects of the antiretroviral drugs on adipocytes in culture. The analysis of the brown adipocyte specific molecular marker UCP-1 gene expression in various HAART-associated lipomas has implicated cells of the brown adipocytes lineage in HAART-induced lipomatosis. The study of the regulation of the mitochondrial biogenesis in brown adipocytes showed that gene expression of the novel mitochondrial transcription factors TFB1M and TFB2M and the coactivator PGC-1-alpha is highly regulated in association with the mitochondrial biogenesis process that takes place during brown adipocyte differentiation. Gene expression of these factors is regulated positively by positive agonists of differentiation such as insulin and rosiglitazone. In contrast, noradrenaline down-regulates TFB1M and TFB2M gene expression in differentiated brown adipocytes, in a beta-adrenergic-mediated, protein synthesis-independent, process. PGC-1-alpha gene expression is highly induced by noradrenaline, PPAR-gamma agonists and RXR agonists in differentiated brown adipocytes. These inductions are protein synthesis- independent, are blocked by a PPAR-gamma antagonist and do not depend on the activation of adrenergic receptors. Therefore, we describe a new regulatory pathway of PGC-1-alpha gene expression in brown adipocytes. The study of the effects of the reverse transcriptase inhibitors antiretroviral drugs on brown adipocytes led us to conclude that specific disturbances in brown adipocytes depots may contribute to HAART-induced lipodystrophy. Mitochondrial depletion does not appear to be the only mechanism explaining adverse effects in brown adipocytes, since there is evidence of compensatory mechanisms that maintain mtDNA expression and because UCP-1 gene expression is specifically altered. Lastly, we developed a cellular model of human white adipocytes in primary culture and we used it to analyse the effects of the antiretroviral drug didanosine. Our results demonstrate that human preadipocytes in primary culture can differentiate into adipocytes showing the morphological, genetic and functional characteristics of the human white adipocytes. The antiretroviral drug didanosine blocks the mitochondrial function of the white adipocytes.