Generació i detecció de mutacions en organismes d'interès comercial

Abstract

[spa] Des del neolític fins a l'època actual, s'han modificat algunes varietats de plantes per tal d'aconseguir incrementar la producció de llavors i fer-les aptes per al cultiu. La dispersió i l'increment de la variabilitat genètica d'algunes espècies va permetre aïllar individus amb característiques concretes. Actualment a partir de la informació genètica disponible i gràcies als avenços en biologia molecular es possible millorar els cultius per tal d'incrementar el rendiment i la producció dels cultius. L'objectiu principal d'aquest treball de tesi ha estat la millora genètica d'una població d'arròs i d'una de llevat mitjançant la tecnologia de la genètica reversa. Utilitzant la informació de gens d'interès i la seva funció s'han buscat individus dins d'una població que continguin mutacions que desactivin la funció de les proteïnes codificades per aquests gens. Per tal d'incrementar la variabilitat genètica de la població s'ha emprat mutagènesi química introduint mutacions aleatòries. Per tal de detectar les mutacions introduïdes en la població es va millorar el sistema de detecció de mutacions mitjançant un garbellat molecular emprant endonucleases presents en certs extractes crus de vegetals. Aquest sistema parteix de l'amplificació mitjançant una reacció en cadena de la polimerasa (PCR) de la regió o del gen d'individus que es volen rastrejar en busca de mutacions. Seguidament a l'amplificació de fragments s'incrementa la temperatura per tal de poder separar les cadenes de DNA i s'equilibra de nou permetent que es tornin a aparellar. Durant aquest procés i en cas d'existir una mutació es formarà un desaparellament de bases que provocarà una alteració en la topologia del DNA. Certs extractes crus de vegetals contenen endonucleases que detecten i tallen aquests desaparellaments essent detectats en un gel d'acrilamida mitjançant un escàner. En aquesta tesi es va testar l'ús d'una endonucleasa provinent de l'extracte cru de fonoll i la seva capacitat de detectar individus mutants dins d'un grup salvatge. En el garbellat molecular de llevat (Saccharomyces carlsbergensis) es va buscar mutants pel gen Met10 per tal d'aconseguir desactivar la funció del gen responsable de passar els sulfits a sulfurs. Al desactivar aquest gen, l'organisme incrementava la producció de sulfits que és un conservant alimentari. Per tal d'estudiar la quantitat de mutagen i el temps d'exposició que eren necessaris per poder determinar la freqüència de mutacions es va generar una soca de llevat marcador (Saccharomyces cerevisiae) que portava insertat un gen de fluorescència. A partir del càlcul de la supervivència i de la pèrdua de fluorescència es podia determinar la citotoxicitat i la genotoxicitat de certs mutàgens a diferents temps d'exposició. En el cas de l'arròs (Oryza sativa) , s'ha utilitzat un sistema nou d'incrementar la variabilitat genètica en una població a partir de la mutagènesi de calls embriogènics. D'aquesta forma s'obtenen noves varietats mutants amb plena capacitat de passar la mutació a les següents generacions evitant l'efecte mosaic i reduint el temps d'obtenció d'una nova varietat en comparació a la mutagènesi de llavors. Utilitzant aquesta nova tècnica pionera es va generar una població mutant d'arròs provinent de call i es va garbellar buscant mutacions en dos gens relacionats amb l'increment de producció de les llavors. En aquest cas s'ha treballat amb el gen ACS (1-aminocyclopropà-1 carboxilat sintasa) que intervé en la síntesi d'etilè, hormona responsable de la senescència i mort cel·lular programada. Al desactivar aquest gen, s'evita temporalment que la senescència de les fulles interrompi la síntesi i transport de sucres des de la fulla bandera fins a la llavor durant el procés final de la maduració del gra. Per altra banda s'ha garbellat la població d'arròs pel gen SGR que intervé en els processos de degradació de la clorofil·la durant els processos de senescència on la desactivació d'aquest gen evitaria la pèrdua estructural del fotosistema mantenint temporalment verda la planta.

[eng] "Generation and detection of mutations in commercial interest organisms" TEXT: Since the ancient ages to these days the human being had modified some vegetal varieties increasing the crop yield. The spread of seeds and the rise of genetic variability of cultivable species let human being the isolation of plants with improved characters. Nowadays we can use the genetic information and the advances in molecular biology to improve the crop's yield. The main objective of that thesis was the genetic improvement of a rice crop population and a brewer yeast strain using the genetic reverse approach. Using the knowledge of protein function and genetic information of certain characters we have screened a mutant population searching for an individual which carries a dysfunction protein for a concrete gene. We used a chemical mutagenesis to introduce random mutations increasing the genetic variability. We improved a system to detect the mutations by molecular screening using endonucleases that some vegetal crude extracts contain. Our technique starts with fragment amplification from a gene of our mutated population using a polymerase chain reaction assay. Next step consist in increasing the temperature to separate the templates and decrease the temperature letting DNA reannealing and forming a hybrid with mutant and non mutant templates. Certain plant crude extracts contain endonucleases that recognize the loops formed in mistmatch templates and cut the DNA allowing the detection in a scanner after the samples run in an acrilamide gel electrophoresys. I tested fennel crude extract endonucleases to detect a single mutation in a pool of DNA. In the second part of the thesis we screened a yeast mutant population searching for Met10 gene that codifies for a sulphite reductase. The lost of function of Met10 gene increases the sulphite production, a compound used in brewery as aroma and flavor preservative. We also screened a rice population using a new system to increase the genetic variability performing a mutagenesis on embryonic callus. We screened for mutants in ACS gene (1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase) responsible of ethylene synthesis and in SGR gene (staygreen), related in the structural desestabilization of the photosystem. Both genes are related in senescence during the grain filling and the lost of their function retard the senescence allowing the plant to continue filling the grain and increasing the yield.