Caracterización de la entrada de Ca2+ "capacitativa" en células trabeculares

Abstract

[spa] El glaucoma es una de las principales causas de ceguera parcial o total e irreversible en el mundo. Los avances en su estudio revelan la compleja naturaleza multifactorial de la enfermedad que consiste finalmente en un daño del nervio óptico (neuropatía). El incremento de la presión intraocular (PIO) prolongado en el tiempo es uno de los factores de riesgo más significativo y reconocido para el desarrollo de esta enfermedad. Este incremento puede causar lesiones en el nervio óptico por deformación mecánica y/o cambios fisiopatológicos en una zona de la retina dónde se sitúan las células ganglionares del nervio. La PIO es resultado del balance entre la producción y drenaje del humor acuoso. El humor acuoso es un fluído derivado de plasma sanguíneo, producido en los procesos ciliares, que baña la cámara anterior del ojo para alimentar sus estructuras avasculares y mantener la tensión mecánica adecuada del globo ocular, y es drenado, principalmente, a través de la malla trabecular o trabéculo. Se sabe que el incremento de la contracción de este tejido implica una disminución en la facilidad de drenaje del humor acuoso y un aumento de la PIO. La presencia incrementada de endotelina-1 (ET-1), potente vasoconstrictor, en humor acuoso de pacientes glaucomatosos plantea algunas cuestiones que abordamos en este trabajo de tesis doctoral. Estas sustancias (endotelina-1, bradiquinina) son agonistas de receptores acoplados a proteína Gq que activan la vía de la fosfolipasa C (vía PLC- inositol trifosfato y diacilglicerol) y podrían tener un efecto contráctil, también, sobre la malla trabecular dado que activan la depleción de Ca2+ intracelular. El objetivo principal de este trabajo de tesis doctoral ha sido identificar y caracterizar un tipo de corriente de entrada de calcio extracelular (vía principal de entrada de calcio en células no excitables), llamada corriente 'capacitativa' de Ca2+ o dependiente del vaciado de Ca2+ de los depósitos intracelulares (ICCE o ISOC) y su posible implicación en la función de contracción/relajación de las células trabeculares y en consecuencia del tejido. Identificamos distintos tipos de corrientes capacitativas de Ca2+ en cultivos primarios de células trabeculares en modelo bovino y humano, tras el estímulo con sustancias vasoconstrictoras y tapsigargina. Para la caracterización farmacológica usamos bloqueadores típicos de la ICCE (2-APB, lantánidos, SKF96365) y registramos la evolución de la activación de ICCE mediante registros electrofisiológicos, testeando nuevamente bloqueadores conocidos de este tipo de corrientes. Observamos cómo en algunos casos las corrientes capacitativas son selectivas para el Ca2+ y en otros (vía PLC), en cambio, aparecían formas de corrientes catiónicas no selectivas. Detectamos mediante western blot la presencia de proteínas de canal tipo TRPC (TRPC1 y TRPC4) que forman canales catiónicos en membrana y pueden ser activados vía PLC, posibles mediadores de la ICCE en células trabeculares. La técnica de microscopía de tracción permitió estudiar la evolución de la contracción de la célula por estímulo con sustancias vasoconstrictoras. Obtuvimos medidas cuantitativas y la distribución de fuerzas en la célula durante la contracción. Estos resultados revelaron que la contracción inducida por estas sustancias depende primeramente de la depleción de Ca2+ intracelular y curiosamente, el Ca2+ extracelular regula, disminuyendo, la intensidad de esa contracción. Mostramos en este trabajo, la existencia de la ICCE en células trabeculares y sugerimos el papel de esta vía de entrada de Ca2+ como señal autoreguladora del proceso de contracción celular y su posible efecto en la función evacuadora del tejido.

[eng] High concentrations of endothelin-1 (ET-1), one of the most potent vasoconstrictor peptide, has been found in the aqueous humor of glaucomatous eyes. It is said that vasoconstrictor substances as ET-1 or bradykinin could induce contraction of trabecular meshwork tissue (TM) and decreases the aqueous humour outflow facility increasing the intraocular pessure (IOP) and the risk of glaucoma. The aim of this study is the calcium signalling, mainly, the characterization of the calcium influx/entry in these cells, the identification of capacitative calcium entry (ICCE) or, also called, store-operated calcium entry (ISOC) in trabecular cells and their role on cell contraction. We found these currents in cell culture of bovine and human trabecular cells and in a human cell line, too, using fluorescence techniques and electrophysiology recordings. They are stimulated by the intracellular Ca2+ depletion from stores via IP3 (bradykinin, endothelin) and blocking the Ca2+-pump of endoplasmic reticulum (thapsigargin). These currents are blocked or inhibited by certain lanthanids ions, 2-APB or SKF96365. Western blots showed the presence of certain members of the Transient Receptor Potential (TRP) channels subfamily C (TRPC1 and TRPC4). The pharmacology of inhibition of the Ca2+ influx suggests the TRPC channels and store-operated calcium channels as mediators. The measurements of cell traction evolution by traction microscopy maps stimulating with vasoconstrictor substances were useful to determine store-operated Ca2+ entry may not be necessary for cell contraction in TM cells but may contribute to modulate cell contractility and so, the aqueous humour outflow facility.