Estudi de les vies del TNF/TNFR2 i del CD200/CD200R en el rebuig xenogènic

Abstract

[cat] Les aplicacions xenogèniques podrien anar des del xenotrasplantament d'òrgans sòlids, a l'empelt de teixits o cèl·lules. El principal obstacle per a la seva aplicació és la forta resposta immunitària generada pel xenoempelt, mediada tant per mecanismes cel·lulars com humorals. Diverses vies de senyalització i molècules estan relacionades amb aquest rebuig. En aquest treball s'estudien la via del TNF/TNFR i del CD200/CD200R. El TNFα s'uneix específicament a dos receptors, el TNFR1 i el TNFR2. Diferents estudis han demostrat la seva implicació en el rebuig agut de l'empelt xenogènic. En aquest treball s'ha identificat i caracteritzat diverses variants del TNFR2 porcí generades a partir de dos tipus diferents de splicings. El primer, provoca la deleció de l'exó 4, per homologia amb la seqüència humana. El segon engloba el que correspondria per homologia als exons 7 al 10 humans i provoca que la predicció de la proteïna resultant sigui soluble. En els experiments de PCR en temps real es va detectar els dos tipus de splicing a nivell de RNA en tots els teixits analitzats. Els nivells globals més elevats els trobem en cèl·lules del sistema immunitari com els PBMC o els monòcits aïllats i en òrgans com la melsa i el pulmó. La determinació de les diferents variants per separat mostren com els dos tipus de splicings són més abundants en monòcits aïllats o PBMC. Els estudis de localització subcel·lular ens van permetre identificar dos patrons d'expressió diferents. Per una banda el pTNFR2 té un marcat patró membranal. En canvi, la isoforma que conté el splicing a l'exó 4 és totalment intracel·lular, amb una alta colocalització amb el reticle endoplasmàtic. Tot i així els estudis realitzats amb la tècnica de FRET, han posat de relleu la interacció entre pTNFR2 i pTNFR2ΔE4 en l'espai intracel·lular. Els receptors de TNF formen homotrímers per ser funcionals, en aquest treball també hem demostrat que les proteïnes solubles són capaces de combinar-se entre elles de forma específica i que aquesta combinació és funcional. El CD200 regula l'activitat de les cèl·lules mieloides a través de la interacció amb el seu receptor. Diferents estudis han descrit el paper immunoregulador de la interacció CD200-CD200R en el control del rebuig de l'al·lotrasplantament i del xenotrasplantament concordant. La segona part d'aquesta tesi està dedicada a la identificació i caracterització del CD200 i CD200R porcins. Els resultats obtinguts identifiquen, per primera vegada, el CD200 porcí i tres variants del seu receptor. Una anàlisi bioinformàtica va permetre caracteritzar la molècula i comprovar que té un patró molt similar al descrit pel CD200 d'altres espècies, dos dominis d'immunoglobulines, una transmembrana i una regió citosòlica curta sense motius senyalitzadors coneguts. La primera variant de receptor pCD200R1, té una homologia elevada amb la variant a del receptor humà. La primera i segona variant soluble, el pCD200R2 i pCD200R3, contenen un canvi en el marc de lectura i que fa aparèixer un codó de stop primerenc, just abans de la zona de transmembrana. El receptor porcí té els tres llocs d'unió a CD200 més crítics conservats. Gràcies a la tecnologia de la ressonància de plasmó de superfície, vam determinar que les constant d'afinitats entre CD200-CD200R estan al voltant de 10-7 i 10-8 M tan en sistemes al·logènics com xenogènics. Amb la finalitat d'identificar les proteïnes porcines del CD200 i del seu receptor, es van generar antipèptids i es van produir anticossos policlonals en conills útils tan en anàlisi de Western Blot com per citometria de flux. Els experiments de PCR en temps real van determinar i quantificar l'expressió del CD200 porcí. Els resultat van confirmar que està àmpliament distribuït per diferents teixits i tipus cel·lulars

[eng] Clinical xenotransplantation is precluded by the strong immune rejection of the xenograft in which several molecules and pathways are involved. In this doctoral thesis, we studied the TNF/TNFR2 and CD200/CD200R pathways in the pig-to-human xenogeneic setting. First, we cloned the cDNA of porcine TNF-Receptor 2 and obtained four isoforms, two membrane-bound (pTNFR2 and pTNFR2ΔE4) and two soluble (pTNFR2ΔE7-10 and pTNFR2ΔE4ΔE7-10), generated by 2 different alternative splicings. The global expression and the relative proportion of each alternative splicing were determined by quantitative RT-PCR. All cells/tissues tested expressed the receptor at various levels and had a low-to-moderate percentage of each alternative splicing. We never found pTNFR2ΔE4 on the cell surface, but demonstrated by FRET experiments that it was capable of associating to the full pTNFR2 intracellularly. Next, we produced fusion proteins with the two different extracellular domains and determined their affinity to pig and human TNFα by plasmon resonance. The pTNFR2-GST bound both pTNFα and hTNFα with high and comparable affinity to the human receptor. On the contrary, pTNFR2ΔE4-GST showed no binding to hTNFα and very little to pTNFα. We further confirmed with pull down experiments that pTNFR2 and pTNFR2ΔE4 bound together after producing them simultaneously as soluble fusion proteins with different tags in mammalian cells. Moreover, pTNFR2ΔE4-GST failed to inhibit the hTNFα effect on endothelial cells in a competition assay, but was able to diminish the TNF blockade mediated by pTNFR2-GST. Thus, we reveal a new way the TNF/TNFR pathway is regulated. In other hand, we have cloned porcine CD200 and three variants of its receptor. As in other species, the porcine CD200 mRNA expression was widely distributed in the multiple tissues tested. We produced rabbit anti-peptide and polyclonal antibodies specific for pig CD200 and both detected it successfully by flow cytometry and western blotting. We also examined if ligand and receptor binding was conserved among species by plasmon resonance. Porcine CD200 interacted with human CD200R with an affinity comparable to that of human CD200. Finally, we expressed recombinantly human and porcine CD200 on the surface of porcine cells in order to protect them against xenograft rejection.