Estudi de la regulació transcripcional del gen de CD69

Abstract

[cat] CD69 és una lectina tipus C amb orientació tipus II, que participa en la migració de limfòcits i la secreció de citocines. CD69 s'expressa a la gran majoria de leucòcits durant processos infecciosos, autoimmunitaris i neoplàsics, i s'utilitza àmpliament com a marcador de l'activació del sistema immunitari. El seu targeting amb anticossos monoclonals ha resultat útil en el tractament de malalties en diferents models animals i, per tant, per esbrinar quins són els mecanismes que controlen la seva expressió a la superfície cel•lular és molt important. L’expressió de CD69 és induïble i està fortament controlada a nivell transcripcional. Després de processos d’activació, els transcrits de CD69 es detecten als 30-60 minuts i la proteïna a les 4-6 hores. La present tesi ha estudiat quins són els elements genètics necessaris per a una correcta expressió temporal i espaial de CD69 in vivo.

L’anàlisi de la seqüència de l’ADN en una regió 45Kb per sobre del gen va rebel•lar una conservació evolutiva del promotor i de quatre seqüències no codificants que van ser anomenats CNS1, CNS2, CNS3 i CNS4 (CNS, Conserved Non coding Sequence). Mitjançant experiments de digestió amb DNasa i d’immunoprecipitació de la cromatina, es va veure que aquests CNS eren regions obertes de cromatina amb modificacions epigenètiques específiques. A més, en assajos de luciferasa en cèl•lules T, es va veure que els elements CNS2 i CNS4 mostraven una activitat enhancer constitutiva i induïble. La generació de ratolins transgènics amb el reporter hCD2 va permetre analitzar la seva funció in vivo. El promotor conferia una expressió regulada durant la selecció positiva dels timòcits, però no podia donar suport a una expressió regulada en limfòcits madurs. La inclusió de CNS1 i CNS2 va causar la supressió de l'expressió del reporter i l'addició de CNS3 i CNS4 va donar lloc a una expressió regulada a les cèl•lules T, però no a les cèl•lules B. Vam concloure que CNS1-4 són elements reguladors importants que interactuen tant positivament com negativament amb el promotor de CD69 i que contribueixen de manera diferent a l'expressió CD69 a les cèl•lules T i B.

D’altra banda, l’anàlisi in silico de regions intragèniques del gen de CD69 va revel.lar una estructura de la cromatina específica entre les seqüències codificants I i II (Intró I) que estava associada a nucleosomes posicionats. A més, en aquesta regió del locus CD69 humà es va identificar un lloc nou d’hipersensibilitat que era induïble per estimulació. Una anàlisi en el locus murí va rebel•lar una regió similar d’hipersensibilitat que sembla implicar almenys les primeres 2Kb de l'Intró I. Pel que fa a l’estructura de la cromatina, en timòcits negatius per CD69, aquesta regió intrònica mostrava nivells baixos i intermedis de l'acetilació i dimetilació de la lisina 4 i de la histona H3 respectivament. L’expressió de CD69 en aquest mateix tipus cel•lular durant la selecció positiva es va associar amb una inducció clara de l'acetilació de la histona H3 a l’Intró I. Curiosament, els limfòcits T perifèrics presentaven alts nivells d'aquestes marques de forma independent a l’expressió CD69. Per tant, l'Intró I pot jugar un paper crucial en el control de l'expressió del gen de CD69.

Amb aquesta tesi hem observat que l'epigenètica i els elements distals d’ADN són importants la regulació de l’expressió de CD69, s'han ampliat considerablement els coneixements sobre els possibles mecanismes, que fins ara s'havia focalitzat només en el promotor, i proposa una nova base per a futurs estudis.

[eng] "Transcriptional regulation of CD69 gene". Summary: CD69 is a type II C-type lectin involved in lymphocyte migration and cytokine secretion.CD69 expression represents one of the earliest available indicators of leukocyte activation and its rapid induction occurs through transcriptional activation. In this thesis we examined the molecular mechanism underlying mouse CD69 gene transcription in vivo in T and B cells. Analysis of the 45kb region upstream of the CD69 gene revealed evolutionary conservation at the promoter and at four non-coding sequences (CNS) that were called CNS1, CNS2, CNS3 and CNS4. These regions were found to be hypersensitive sites in DNase I digestion experiments and chromatin immunoprecipitation assays showed specific epigenetic modifications. CNS2 and CNS4 displayed constitutive and inducible enhancer activity in transient transfection assays in T cells. Using a transgenic approach to test CNS function, we found that the CD69 promoter conferred developmentally regulated expression during positive selection of thymocytes but could not support regulated expression in mature lymphocytes. Inclusion of CNS1 and CNS2 caused suppression of reporter expression whereas further addition of CNS3 and CNS4 supported developmental-stage and lineage-specific regulation in T cells but not in B cells. We concluded CNS1-4 are important cis-regulatory elements that interact both positively and negatively with theCD69 promoter and that differentially contribute to CD69 expression in T and B cells. In silico analysis of intragenic regions of CD69 gene also revealed a specific chromatin structure between coding sequence I and II (intron I) associated with positioned nucleosomes. Intron I contained a novel hypersensitive site region that was inducible upon stimulation and, interestingly, its chromatin structure appears to be developmentally regulated. Thus, Intron I may also contain an important DNA regulatory element important for the correct expression of CD69.