Aplicación de técnicas de fluorescencia y microscopía de fuerza atómica al estudio de la interacción lípido-proteína en modelos de membrana

Abstract

[spa] Las proteínas de membrana constituyen entre un 25 y un 30 % de las proteínas presentes en las células, pudiendo estar implicadas, en algunos casos, en mecanismos de resistencia a determinados fármacos. Es por ello de gran interés el estudio de estas proteínas en modelos biomiméticos. El conocimiento existente sobre los fenómenos implicados en el proceso de reconstitución de proteínas transmembranarias en liposomas es limitado. Dicho proceso es fundamentalmente empírico, e implica la utilización de liposomas y surfactantes, así como proteínas con un alto grado de pureza. Estas condiciones son un requisito imprescindible para poder realizar estudios de integración de las proteínas, de su disposición en la bicapa y de su función biológica. La aplicación de técnicas nanométricas, como la microscopía de fuerza atómica (AFM), así como determinados métodos de fluorescencia (cálculo del incremento de potencial electrostático de superficie y anisotropía de la fluorescencia), permiten el estudio del proceso de reconstitución de proteínas. La aplicación de la AFM al estudio de láminas lípido-proteicas y cristales bidimensionales permite el estudio estructural de proteínas de membrana, así como la posibilidad de estudiar en tiempo real y en condiciones biomiméticas este tipo de moléculas, permitiendo, en algunos casos, el diseño de biosensores. La hipótesis de trabajo y objetivo principal de esta Tesis fue el estudio detallado del proceso de reconstitución de dos proteínas transmembranarias, la porina Omp1 de Serratia marcescens y la lactosa permeasa de Escherichia coli (LacY), tomando como modelo para comprobar la posible aplicación de las técnicas utilizadas a este tipo de moléculas, el citocromo c (Cyt c) y la melitina (MLT). Las principales conclusiones a las que se llegó en este trabajo fueron: · Las proteínas Omp1 y LacY presentaron una estructura y estabilidad en solución condicionadas por la presencia de surfactante adecuado. · La solubilización de liposomas con los surfactantes OG y DDM fue estudiada con las composiciones lipídicas: POPC, DMPC:POPC (1:1, mol:mol), POPE:POPG (3:1, mol:mol) y extracto lipídico de E. coli, en las que incorporaron las proteínas de membrana, permitiendo obtener tanto proteoliposomas como láminas lípido-proteicas. · La incorporación de Cyt c, MLT, Omp1 y LacY a la bicapa lipídica produce, en los casos estudiados, variaciones positivas del valor del potencial electrostático de superficie. · Los valores de "delta-phi" demuestran que la incorporación de las proteínas estudiadas se produce tanto por interacción electrostática, como por su balance hidrofília/lipofília. · Se observa una rigidificación de la bicapa lipídica al incorporar la LacY, debida a la reorganización de los lípidos, para conferir estabilidad a la proteína. · La incorporación de la LacY puede inducir la segregación lateral de fosfolípidos, al formarse regiones enriquecidas en las mismas. · La proteína LacY, en forma de dímero, fue cristalizada en 2D, obteniéndose los parámetros de celda: a = 13,15 nm, b = 16,74 nm, gamma = 116º. · La incorporación óptima de proteínas de membrana para dar lugar a cristales 2D, se produce en fosfolípidos como la POPC, que se encuentran en estado fluido durante todo el proceso de cristalización y que no presentan dominios lipídicos. · La inmovilización de proteínas sobre sustratos adecuados es un factor crítico en el control y manipulación molecular necesarios para posibles aplicaciones, como podría ser el diseño y fabricación de biosensores.

[eng] Membrane proteins constitute the 25-30 % of the total proteins cell that can be implicated in processes as drug resistance. The biomimetic models, proteoliposomes and 2D crystals are useful tools to study this kind of proteins. The knowledge about phenomena implicated in reconstitution of membrane proteins into liposomes is limited. Basically, this process is empiric, the presence of liposomes and detergents to form mixed micelles is required, and they are also needed membrane proteins with a high purity degree. These conditions are crucial to study the incorporation of membrane proteins and their insertion into the bilayer, including, in some cases its physiological activity. The application of nanometric techniques, as atomic force microscopy (AFM), and some methods of fluorimetry (obtention of increase of membrane surface potential and fluorescence anisotropy), allow the study of the reconstitution process of membrane proteins. The AFM application to proteolipid sheets and bidimensional crystals lead to obtain structural information of membrane proteins. Additionally there is the possibility to perform studies in real-time and under biomimetical conditions. This fact opens the possibility to design a biosensors based in these proteins. The hypothesis and main objective of this work was the detailed study of the reconstitution process of two transmembrane proteins, the porine Omp1 of Serratia marcescens and lactose permease of Escherichia coli (LacY). cytochrome c and the peptide melitin were used as models to assure the possible application of fluorescence techniques to these proteins. Finally, the main conclusions were: · Liposomes and proteolipid sheets were stables in solution after being extended onto a flat solid substrates. · LacY reconstituted in POPC was crystallized in 2D and visualized using AFM, obtaining a dimmer as a motif. The cell parameters were: a = 13.15 nm, b = 16.74 nm, gamma = 116º, accordingly at a p2 symmetry.