Estudi de la relació estructura funció en metal·lotioneïnes d'invertebrats, protozous i plantes.

Abstract

[cat] Les Metal·lotioneïnes (MTs) configuren una família de proteïnes de baix pes molecular àmpliament distribuïdes entre els éssers vius (des dels protozous i plantes als metazous), riques en cisteïnes (Cys), que uneixen metalls pesants com el Zn, Cu, Cd, Hg,... Tot i que se'ls ha atribuit un paper en la detoxificació metàl.lica, i se n'ha estudiat estructuralment alguns dels seus membres (principalment MTs de vertebrats i fongs) es coneix poc quina és la relació estructura-funció en aquestes MT, i queden encara molts àmbits funcionals per explorar. Aquesta tesi té per objectiu estudiar la relació entre la estructura i la funció de MTs d'Invertebrats, Protozous i Plantes. Amb aquest objectiu s'ha estudiat el comportament coordinatiu les MT de diversos organismes model per a les MT. Les MT estudiades s'han estat sintetitzat heteròlogament en medis rics en Zn, Cd o Cu, i els agregats metall-MT obtinguts han estat analitzats mitjançant diverses tècniques espectroscòpiques i espectromètriques (ICP-AES, ESI-MS, CD, UV, Raman, IR, GC-FPD) i valoracions in vitro de substitució del Zn per Cd o Cu. Quan ha estat necessari, s'han construit formes quimèriques de les MT mitjançant teconologies d'ADN recombinant. Amb aquestes dades s'ha descrit el comportament coordinatiu de cada MT, que s'ha posat en relació amb dades estructurals i/o funcionals. Les MT MTNA, MTNB, MTNC i MTND de Drosophila melanogaster mostren preferència coordinativa per el Cu, tot i que les 3 darreres semblen tenir especificitat funcional per el Cd. La MT de la planta Quercus suber (QsMT) presenta dos dominis cisteínics separats per un espaiador, i elements d'estructura secundària. L'estudi de quimeres de QsMT demostra que l'espaiador participa en la detoxificació in vivo de Cd i Cu en llevats, i en la unió de Cd mitjançant un residu histidina. La MT CeMT2 de Caenorhabditis elegans presenta preferència coordinativa per el Zn. L'estudi de formes mutades indica que CeMT2 és capaç de formar dímers mitjançant la seva His situada a C-terminal, i que el seu plegament no es dòna en dos dominis 9Cys+9Cys en coordinar Zn o Cu. La MT TpMT1 de Tetrahymena pyriformis presenta preferència coordinativa per els metalls divalents, presenta resistència a substituir el Zn per Cd o Cu, i conté elements d'estructura secundària del tipus hèlix alfa en agregats amb Zn o Cd. La MT MT-10-IV de Mytilus edulis presenta un comportament coordinatiu compatible amb un rol homeostàtic, més que no pas amb un paper detoxificador, més atribuible a la seva subfamília homòloga, MT-20. La MT SpMTA de Strongylocentrotus purpuratus presenta propietats funcionals molt diferenciades respecte les MT de mamífer, tot i assemblar-s'hi molt des d'un punt de vista estructural: SpMTA mostra especificitats funcionals envers el Cu, que l'asocien a un paper homeostàtic més que no pas detoxificador. L'estudi d'aquests agregats ha permès també descriure que en la coordinació metàl.lica en MTs i la determinació de les propietats funcionals, a més de la cisteïna, hi intervenen també altre lligands (per exemple, histidina i ions clorur) i nivells estructurals (estructures secundària i quaternària). A més, els anàlisis amb GC-FPD han permès detectar per primer cop la presència de ions sulfur en agregats metall-MT. Des d'un punt de vista metodològic, aquesta tesi ha aportat al camp de recerca nous procediments (com l'ICP-AES àcid, la detecció de dímers per ESI-MS i les covaloracions) i tècniques (com l'estudi de l'estructura mitjançant Raman i IR, i la mesura i detecció de ions sulfur en agregats metall-MT mitjançant tinció de plata, GC-FPD, CD, UV i Raman).

[eng] "STUDY OF THE STRUCTURE-FUNCTION RELATIONSHIP IN METALLOTHIONEINS OF INVERTEBRATES, PROTOZOANS AND PLANTS." Metallothioneins (MTs) are widely-distributed, low molecular weight, Cys-rich proteins, which present the ability to bind heavy metals (Zn, Cd, Cu, Hg,...) Most of the studies have been centred on their detoxification-role and the structural features of vertebrate and fungal members of this family. The goal of this PhD thesis is to study the structure-function relationship in MTs from Invertebrates, Protozoans and Plants, MT groups traditionally ignored from the functional and structural points of view. The coordinative behaviour of several MTs of these groups has been studied by means of heterologous synthesis of metal-MT aggregates in Zn, Cd, or Cu-rich media and subsequent characterization of the in vivo-synthesized purified aggregates (ICP-AES, ESI-MS, CD, UV, Raman, IR, GC-FPD) and titrations with Cu+ or Cd2+ ions. The MT-forms studied in this thesis are D.melanogaster MTNA, MTNB, MTNC, MTND, Q.suber QsMT, C.elegans CeMT2, M.edulis MT-10 IV, T.pyriformis TpMT1, S.purpuratus SpMTA, and some chimerical forms of these MTs, generated by recombinant DNA techniques. The study of the aggregates obtained have demonstrated that other factors than cystein amount and distribution are of importance in the determination of the functional properties, both at the metal-binding (histidine, clorur ions) and structural (secondary and quaternary structures) levels. Moreover, GC-FPD analyses have allowed detecting for the first time the presence of sulphide ions in metal-MT aggregates. This grows unexpectedly the functional and structural possibilities of the MT family. From a methodological point of view, this thesis have generated new analysis processes (as the acid ICP-AES, the detection of MT-dimeric forms or the co-titrations) and technical possibilities (as the structural study by means of Raman and IR spectroscopies or the measurement and detection of sulphide ions in Metal-MT aggregates by Ag staining, GC-FPD, CD. UV and Raman)