La proteïna TolC de "Klebsiella oxytoca"

Abstract

[cat] L'objectiu principal de la tesi va ser estudiar els mecanismes implicats en la resistència a las fluoroquinolones en soques clíniques del gènere "Klebsiella", centrant els estudis en els mecanismes de reflux.Els mecanismes que confereixen resistència als bacteris per un determinat antibiòtic poden ser diversos, des de la inactivació enzimàtica de l'antibiòtic, la modificació de la diana i mecanismes més generals com la disminució de la permeabilitat de la membrana i l'expressió de bombes de reflux. Les bombes de reflux són translocases que es situen a la membrana citoplasmàtica amb capacitat per expulsar fora del bacteri una gran varietat de substàncies mitjançant la força protó-motriu, pel que no requereixen la hidròlisi de l'ATP.Pel que fa les bombes de reflux en bacteris Gram negatius s'ha vist que en Escherichia coli l'operó acrAB codifica per una bomba de reflux però no codifica per cap proteïna de membrana externa (OMP), s'ha descrit que és la proteïna TolC la que actua com a canal de mebrana externa. En el cas de Klebsiella es coneix el sistema de reflux AcrAB com el d'E. coli i en els estudis realitzats en aquest treball s'ha posat de manifest la presència d'aquesta bomba de reflux en les soques clíniques estudiades i la seva implicació en la resistència a les fluoroquinolones mitjançant mesures d'acumulació de ciprofloxacina, efectes de l'antibiòtic sobre el creixement i corbes de mort.No es coneix quina és la proteïna formadora de canal de membranqa externa que està associada a la bomba de reflux AcrAB en Klebsiella. La cerca d'aquesta proteïna associada a la bomba de reflux va ser l'objectiu prinicipal d'aquesta tesi doctoral. Es va posar de manifest la presència de la proteïna TolC en una soca clínica de Klebsiella oxytoca, de la qual es va determinar la seva seqüència i es va comparar amb la d'altres enterobacteris obetenint un elevat percentatge d'identitat, especialment amb la proteïna TolC de Enterobacter aerogenes.Una vegada coneguda la seqüència de la proteïna TolC de K. oxytoca es va realitzar una aproximació al model estructural de la proteïna obtenint una estructura molt similar a la descrita en E. coli. La diferència més destacable s'observà en les cadenes que s'estenen cap a l'exterior del bacteri, aquestes estructures tenen com a funció ser receptores de bacteriocines i fags, on TolC de K. oxytoca presentava una menor longitud. En l'estudi de sensibilitat a colicines s'observà la resistècnia a colicina E1 de la soca clínica de K. oxytoca, pel que la menor longitud de les cadenes exteriors de la proteïna TolC modifica la seva funció com a receptor de colicines. Estudis fisiològics realitzats en la proteïna TolC de K. oxytoca van demostrar que aquesta proteïna forma canals transmembrana en bicapes lipídiques artificials amb una conductància aproximada de 80 pS en KCl 1M i que presenta una forta selectivitat catiònica.