Estratègies de diagnòstic genètic en fetus amb malformacions congènites. Correlació genotip-fenotip

Abstract

[cat] Les alteracions cromosòmiques constitucionals representen una de les principals causes d’anomalies congènites a la població, i el seu diagnòstic durant l’etapa prenatal és el principal objectiu de la majoria de procediments invasius que es realitzen durant l’embaràs. Actualment, el cariotip convencional és el gold standard del diagnòstic citogenètic prenatal, però els avanços tecnològics dels últims anys han portat al desenvolupament de tècniques de citogenètica molecular que ofereixen característiques molt atractives, la principal de les quals és l’elevada resolució. Donat que el paper que han de tenir aquestes tècniques durant l’etapa prenatal encara no està ben definit, els objectius de la present tesi han estat: a) determinar el potencial diagnòstic i la utilitat del cariotip i les tècniques de citogenètica molecular Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) i Chromosomal Microarray-based Analysis (CMA) en diagnòstic prenatal, especialment per a l’estudi de gestacions amb troballes ecogràfiques; i b) valorar la necessitat de modificar els procediments actuals de diagnòstic citogenètic prenatal. En primer lloc, s’han revisat els resultats dels 29.883 cariotips en líquid amniòtic realitzats entre 1998 i 2009 a l’Hospital Clínic de Barcelona. Els resultats obtinguts corroboren que el cariotip és una eina efectiva i robusta per a l’obtenció del cariotip fetal, revelant alteracions cromosòmiques en el 2,9% de les gestacions que es sotmeten a un procediment invasiu. La translucidesa nucal incrementada i les anomalies ecogràfiques destaquen com a indicadors excel•lents d’anomalia cromosòmica. En segon lloc, s’ha avaluat la utilitat de l’MLPA subtelomèrica per a l’estudi de gestacions amb troballes ecogràfiques i cariotip normal. Dels 229 fetus analitzats, 3 presentaven desequilibris subtelomèrics críptics (1,3%). Donat que la freqüència d’aquests desequilibris és baixa, i a més la correlació genotip-fenotip observada és pobra, l’MLPA subtelomèrica no sembla ser una eina crucial per a l’estudi d’aquestes gestacions. D’altra banda, s’ha estudiat la idoneïtat de reemplaçar els estudis de FISH de la regió 22q11.2 per kits d’MLPA dissenyats per a l’estudi d’aquesta regió i altres regions genòmiques associades a cardiopaties. S’han analitzat mitjançant aquests kits 55 gestacions amb troballes cardíaques, cariotip normal i estudi de FISH negatiu per a la microdeleció típica de 22q11.2, i no s’ha detectat cap anomalia. Aquest fet, juntament amb que l’MLPA presenta una taxa de repetició i de no obtenció de resultats superiors a la FISH, i que generalment requereix cultiu cel•lular, indica que la FISH hauria de seguir sent la tècnica d’elecció per a l’estudi de fetus amb troballes cardíaques (enfront l’MLPA). També s’ha volgut determinar la freqüència dels diferents tipus d’alteracions cromosòmiques, tant microscòpiques com críptiques, en fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques. L’anàlisi retrospectiu dels resultats obtinguts en el període 2009-2011 a l’Hospital Clínic de Barcelona en aquest grup de gestacions (N=276) ha revelat una freqüència d’anomalies cromosòmiques microscòpiques i casos de Síndrome de la deleció cromosòmica 22q11.2 del 15,9% i 6,4%, respectivament; uns resultats que corroboren la forta associació existent entre troballes ecogràfiques cardíaques i anomalies cromosòmiques. A més, aquesta associació varia significativament en funció del tipus de troballa ecogràfica cardíaca i de la presència d’anomalies extracardíaques. D’altra banda, s’han analitzat mitjançant array CGH 51 fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques, cariotip normal, i sense estudi o resultat de FISH negatiu per a la Sd. de la deleció cromosòmica 22q11.2. En aquest grup de gestacions, la taxa de detecció de variants en número de còpia patogèniques ha estat del 2%, i no s’han detectat variants de significat clínic incert. Si en la nostra sèrie de 276 gestacions amb troballes ecogràfiques cardíaques s’hagués utilitzat l’estratègia QF-PCR + CMA enlloc de cariotip, totes les anomalies cromosòmiques amb repercussió clínica clara diagnosticades per citogenètica convencional s’haguessin identificat, s’haguessin detectat els casos de delecions de 22q11.2, i s’hagués incrementat un 2% el nombre de casos diagnosticats. Per tant, aquests resultats mostren el potencial de les plataformes de microarray per al diagnòstic prenatal de fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques. Finalment, s’han utilitzat les tècniques de citogenètica molecular FISH, MLPA i/o CMA per a la caracterització de 6 alteracions cromosòmiques visibles al cariotip però de difícil caracterització per citogenètica convencional. En tots els casos, la utilització d’aquestes tècniques ha contribuït a la correcte descripció de l’alteració identificada, posant de manifest la seva utilitat quan s’utilitzen de forma complementària al cariotip. L’elaboració d’aquesta tesi i la literatura recentment publicada evidencien la necessitat d’un nou plantejament dels protocols clínics de diagnòstic citogenètic prenatal, especialment en relació a la utilització de plataformes de microarray en diagnòstic prenatal

[eng] Strategies for genetic diagnosis of fetuses with congenital malformations. Genotype-phenotype correlations. Constitutional chromosomal abnormalities represent one of the main causes of congenital abnormalities in the population, and their diagnosis during pregnancy is the main objective of most invasive procedures. Nowadays, conventional karyotyping is the gold standard for prenatal cytogenetic diagnosis, but recent technological advances have led to the development of molecular cytogenetic techniques which offer much higher resolution. Since there is still not a consensus on the role of these techniques in prenatal diagnosis, the goals of the present PhD work have been: a) to determine the diagnostic potential and usefulness of karyotype and molecular cytogenetic techniques Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) and Chromosomal Microarray-based Analysis (CMA) in prenatal diagnosis, especially in pregnancies with ultrasound findings; and b) to establish the need for modifications in current prenatal cytogenetic diagnostic protocols. The results obtained: - Corroborate the effectiveness and robustness of conventional karyotyping. The observed detection rate of chromosomal abnormalities in 29,883 consecutive amniotic fluid samples has been 2.9%, with increased nuchal translucency and ultrasound abnormalities being excellent indicators for chromosomal abnormalities. - Suggest that subtelomeric screening in pregnancies with ultrasound findings and normal karyotype is not a crucial tool, as detection rate of subtelomeric imbalances is low (1.3%; 3/229), and genotype-phenotype correlations are poor. - Reveal that FISH of 22q11.2 region is preferred to MLPA kits specific for this chromosome region and other genomic regions previously associated with congenital heart defects. - Reveal a strong association between cardiac ultrasound findings and chromosomal abnormalities, both microscopic and cryptic. In pregnancies with cardiac findings, the observed frequency of microscopic chromosomal abnormalities and chromosome 22q11.2 deletion syndrome has been 15.9% (44/276) and 6.4% (5/78), respectively. Moreover, CMA has been performed in 51 fetuses with cardiac ultrasound findings, normal karyotype and negative or no FISH study for chromosome 22q11.2 deletion syndrome, and the detection rate of pathogenic copy number variants has been 2%, without detection of variants of unknown clinical significance. If in the initial series of 276 pregnancies the strategy QF-PCR + CMA would have been applied; all the chromosomal abnormalities with clear clinical repercussion diagnosed by conventional cytogenetics would have been identified, together with the deletions of 22q11.2 region and an extra 2% of chromosomal abnormalities. These results show the potential of CMA for the prenatal diagnosis of these pregnancies. - Show the usefulness of the molecular cytogenetic techniques FISH, MLPA and CMA when used as a complement to conventional karyotyping in cases with chromosomal abnormalities not accurately characterizable by conventional cytogenetics. Accordingly, the results obtained suggest the need for updating current prenatal cytogenetic diagnostic protocols.