Caracterización Genética y Funcional de la Proteína ns P1a/4 de Astrovirus Humano

Abstract

[spa] Los astrovirus humanos son virus de gastroenteritis infantiles y tienen un genoma RNA monocatenario de polaridad positiva organizado en tres pautas abiertas de lectura (ORF1a y ORF1b para las proteínas no estructurales, y ORF2 para las proteínas estructurales). Actualmente se desconoce la función de muchas de sus proteínas no estructurales. No obstante, en la región C-terminal de la poliproteína nsP1a codificada por el ORF1a (denominada nsP1a/4) se han descrito multitud de motivos que podrían tener una función biológica relevante para su ciclo replicativo. Entre otros, cabe destacar la presencia de una región hipervariable (HVR), que se ha relacionado con un posible papel en la replicación del RNA vírico, y una putativa región codificante para una proteína VPg. Bajo estas premisas los objetivos de esta tesis fueron profundizar en la caracterización de la proteína nsP1a/4 tanto a nivel de variabilidad genética como a nivel funcional y confirmar experimentalmente la existencia de una VPg unida covalentemente al genoma vírico. El análisis de la HVR de la proteína nsP1a/4 mostró un grado elevado de variabilidad, sobre todo a nivel de aminoácidos, con una buena tolerancia a las inserciones y deleciones y a los cambios no sinónimos. Por otro lado, el análisis filogenético de la HVR de 104 aislados permitió la identificación de 12 genotipos diferentes y el análisis de la carga vírica excretada en muestras clínicas correspondientes a distintos genotipos derivados de la HVR mostró una correlación significativa entre estos dos parámetros. Aprovechando la variabilidad de esta región del genoma de astrovirus, se desarrolló también un método de tipado molecular por amplificación por RT-PCR y análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Con el fin de profundizar en la caracterización de la proteína nsP1a/4 y establecer posibles diferencias funcionales entre genotipos, se clonaron y expresaron en el sistema de baculovirus varias formas de la proteína correspondientes a los genotipos IV, V, VI y XII. Así, para todos los genotipos estudiados, se observó que existen diferentes isoformas de la proteína, una isoforma no fosforilada y diferentes isoformas fosforiladas, y que las isoformas no fosforiladas interaccionan entre sí formando oligómeros. Además, dada la implicación de la proteína nsP1a/4 en el proceso de replicación del RNA, se estudió la potencial interacción de la proteína nsP1a/4 con la polimerasa vírica. Para todos los genotipos estudiados, se observó que la proteína nsP1a/4 interacciona con la polimerasa formando un heterodímero. En cuanto a la forma de la nsP1a/4 que interacciona con la polimerasa, los resultados mostraron que lo hacen tanto la isoforma no fosforilada como la fosforilada, si bien en este caso sí que se observaron diferencias entre los distintos genotipos. Concretamente, la isoforma fosforilada de la proteína nsP1a/4 correspondiente al genotipo VI presentó un patrón de interacción más fuerte con la polimerasa en comparación con la isoforma no fosforilada. En cuanto a la existencia de una proteína VPg, el análisis de las proteínas co-purificadas con el RNA de astrovirus reveló la presencia de una proteína con un peso molecular (13-15 kDa) compatible con el de la VPg predicha computacionalmente. La identificación de un péptido de 15 aminoácidos confirmó que la región codificante para la VPg se localiza dentro de la región codificante para la proteína nsP1a/4 y el tratamiento proteolítico del RNA de astrovirus con Proteinasa K demostró que dicha proteína resulta esencial para la infectividad del virus. Finalmente, el uso de distintas formas mutadas de la VPg permitió identificar el residuo Tyr693 como potencial residuo de unión al RNA. Así pues, la mejor caracterización de las proteínas nsP1a/4 y VPg de astrovirus proporciona las bases para su posible aplicación en el futuro como nuevas dianas antivíricas.

[eng] Human astroviruses are single-stranded (+) RNA viruses that frequently cause gastroenteritis in children. Upon infection, nonstructural proteins are translated as two polyproteins, nsP1a and nsP1ab, which are further proteolitically processed. The roles of their mature products are mostly unknown. However, several domains have been described in the nsP1a C-terminal end protein (also named nsP1a/4 protein), including a putative VPg protein and a hypervariable region (HVR). Moreover, recent data support the correlation between nsP1a/4 variability and higher replication properties. The main goals of this study were to characterize the genetic variability and functionality of nsP1a/4, and to experimentally prove the existence of a VPg protein. Sequencing the HVR of 104 isolates showed a significant degree of amino acid variability, composed mainly of insertions and deletions and non- synonymous mutations. Based on this variability, 12 genotypes were established, and a RFLP typing method was developed. Moreover, a significant correlation was observed between viral load in feaces and certain genotypes, confirming the influence of nsP1a/4 variability on the replication phenotype. To better understand the role of HVR-derived genotypes in viral replication, four HVR genotypes (IV, V, VI, and XII) of nsP1a/4 proteins, as well as the astrovirus polymerase, were expressed in the baculovirus system. A nonphosphorylated isoform and different phosphorylated isoforms of nsP1a/4 proteins were detected for all genotypes, and nonphosphorylated isoforms formed oligomers. Coexpression of the viral RNA polymerase resulted in the formation of heterodimers. This interaction involved both the unphosphorylated and the phosphorylated isoforms for all genotypes, but the phosphorylated isoforms of nsP1a/4 type VI showed a stronger interactive pattern with the polymerase than the nonphosphorylated isoform. Regarding the presence of a VPg protein, a protein of 13-15 kDa was identified after RNAse treatment of RNA purified from infected cells, and the protein sequence obtained confirmed its inclusion in the nsP1a/4 coding region. Proteolytic treatment of the genomic RNA lead to a loss of infectivity, showing that astrovirus VPg is essential for viral infectivity and mutagenesis of its Tyr-693 was lethal for HAstV replication, supporting its functional role in the covalent link with the viral RNA. The better characterization of nsP1a/4 and VPg proteins will allow us to assess their potential use as new antiviral targets.