Regulació de la metamorfosi en insectes hemimetàbols i holometàbols. Caracteritzaoió funcional del gen E93 i del procés de sumoilació

Abstract

[cat] La maduració sexual dels animals està controlada per hormones. En els insectes alats aquesta maduració es coneix amb el nom de metamorfosi, i pot anar acompanyada d’una completa reorganització de la majoria d’òrgans i estructures juvenils (insectes holometàbols), o bé limitar-se a uns pocs teixits, principalment les ales i la genitàlia (insectes hemimetàbols). La metamorfosi dels insectes holometàbols (metamorfosi completa), que va aparèixer fa uns 300 milions d’anys a partir d’insectes hemimetàbols (metamorfosi incompleta), ha fet que aquest grup animal assolís un gran èxit evolutiu, ja que la diferent morfologia entre les formes juvenils i adultes els permet explotar hàbitats diferents i no competir entre elles. En tots els insectes els canvis metamòrfics estan controlats per dues hormones, la 20-hidroxiecdisona (20E) i l’hormona juvenil (HJ). La 20E s’encarrega d’induir les transicions entre les diverses mudes i estadis del desenvolupament, mentre que l’HJ modula la naturalesa d’aquestes transicions. La present tesi doctoral pretén aprofundir en el coneixement de la regulació molecular de la metamorfosi mitjançant l’estudi del procés de sumoilació, per una banda, i de la funció del gen E93 de l’altra. Per fer-ho s’han utilitzat tres models d’insectes: la panerola Blattella germanica (hemimetàbol), l’escarabat Tribolium castaneum (holometàbol basal) i la mosca Drosophila melanogaster (holometàbol modificat). La sumoilació és una modificació posttraduccional que consisteix en la unió de manera reversible d’una proteïna petita, anomenada Sumo (de l’anglès Small Ubiquitin-like MOdifier), a una proteïna diana. Aquesta unió comporta la modificació de les propietats de la proteïna diana canviant-ne la conformació, la localització subcel•lular, la capacitat d’interacció amb altres proteïnes o la capacitat d’unió al DNA (en el cas dels factors de transcripció), entre d’altres. En els insectes, l’estudi del procés de sumoilació s’havia centrat fins ara en l’holometàbol D. melanogaster, on s’ha vist que és imprescindible per a l’inici de la metamorfosi. En aquesta tesi doctoral s’ha descrit la funció d’aquest procés en el desenvolupament postembrionari d’un insecte molt més basal, B. germanica. Aquesta panerola té dos paràlegs Sumo, BgSumo1 i BgSumo3, mentre que D. melanogaster en té tan sols un, Smt3. Aquest fet permetia, doncs, estudiar l’evolució funcional de la sumoilació en els insectes, i com aquesta funció està distribuïda en animals amb dos proteïnes Sumo. Així, mitjançant la tècnica de l’RNA d’interferència in vivo, s’ha comprovat que la sumoilació és essencial per a la supervivència durant el desenvolupament postembrionari de B. germanica. A més, s’ha vist que el paràleg BgSumo1 és necessari per a que es doni correctament la muda imaginal, per a la transducció del senyal de la 20E durant aquesta muda i per a la proliferació de l’epiteli fol•licular de l’oòcit basal. D’altra banda, s’ha comprovat que diversos receptors nuclears que conformen la via de senyalització de la 20E, imprescindible per a l’inici de la metamorfosi, són capaços de sumoilar-se en condicions in vitro. La segona part del treball se centra en l’estudi funcional del factor de transcripció E93. Aquest, descrit prèviament en D. melanogaster com el responsable de la transmissió del senyal de la 20E en el procés de mort cel•lular programada durant la metamorfosi, s’ha comprovat en aquesta tesi que actua de regulador molt més general dels processos metamòrfics. Així, s’expressa fortament durant el període metamòrfic en els tres models estudiats (B. germanica, T. castaneum i D. melanogaster), i la seva absència bloqueja aquest procés. En l’hemimetàbol B. germanica, la manca de BgE93 durant el darrer estadi nimfal provoca la formació de nimfes supernumeràries, que mai assoleixen l’estadi adult. En l’holometàbol basal T. castaneum, per altra banda, l’absència de TcE93 impedeix la diferenciació adulta que es dóna durant la fase pupal i provoca la muda a un segon estadi pupal supernumerari. Finalment, en l’holometàbol modificat D. melanogaster també provoca un bloqueig general de la metamorfosi. A més, en aquests tres insectes E93 s’encarrega de reprimir l’expressió dels factors de transcripció Broad i Krüppel homolog-1, la presència dels quals impedeix la diferenciació adulta durant el darrer estadi juvenil dels insectes. Per tot això, aquest treball ha pogut descriure el factor de transcripció E93 com l’especificador adult dels insectes alats, pas essencial per avançar en el coneixement de la regulació de la metamorfosi i en l’estudi de l’aparició de la metamorfosi completa a partir d’insectes hemimetàbols.

[eng] All immature animals undergo remarkable morphological and physiological changes to become mature adults. In winged insects, metamorphic changes are either limited to a few tissues (hemimetaboly) or involve a complete reorganization of most tissues and organs (holometaboly). In both cases, adult differentiation requires a temporally regulated balance between cell death, tissue growth and morphogenesis. Two hormones control this balance, the steroid 20-hydroxyecdysone (20E) and juvenile hormone (JH). The main goal of this thesis is to characterize the molecular mechanisms underlying the metamorphic process in insects through (i) the study of sumoylation and (ii) the functional characterization of the E93 transcription factor. To this aim, the hemimetabolous cockroach Blattella germanica, as well as the basal holometabolous beetle Tribolium castaneum and the highly modified holometabolous fly Drosophila melanogaster were used. Sumoylation is a post-translational modification that consists on the covalent binding of a small protein, called Sumo (Small Ubiquitin-like MOdifier), to a target protein. This modification is involved in the regulation of various cellular processes such as nuclear-cytosolic transport, transcriptional regulation and progression of cell cycle, among others. Notably, whereas D. melanogaster has only one Sumo protein (Smt3), B. germanica has two, BgSumo1 and BgSumo3. In this thesis, by using RNAi in vivo experiments we have shown that, whereas BgSumo3 is dispensable for the correct development of B. germanica, reduction of BgSumo1 levels resulted in severe defects during the metamorphic transition, including a marked developmental delay due to impaired activation of the ecdysone-triggered signaling cascade. Furthermore, we have shown that all the proteins belonging to the ecdysone-dependent transcriptional cascade of nuclear hormone receptors (BgEcR, BgRXR, BgE75, BgHR3 and BgFTZ-F1) are SUMOylated in vitro. The second part of the thesis is focused on the functional characterization of the E93 gene. First described as a dedicated regulator of cell death, we have demonstrated that this factor controls all the metamorphic transformations in insects. Thus, in the hemimetabolous B. germanica the absence of E93 during the last nymphal instar causes the formation of supernumerary nymphal instars. Moreover, in the holometabolous T. castaneum and D. melanogaster the depletion of E93 impairs adult differentiation during the pupal period and, in the beetle, also causes the formation of a supernumerary pupal stage. Furthermore, E93 controls the essential downregulation of the anti-metamorphic factors Broad and Krüppel homolog-1, two proteins whose presence blocks adult metamorphosis during the pupal stage. In conclusion, our data demonstrate that, despite the evolutionary distance and the differences in the developmental strategies to reach adulthood, E93 is the universal adult specifier in winged insects.