Estudio del fago portador de la “Cytolethal Distending Toxin” de tipo V en el medio ambiente

Abstract

[spa] La toxina Cdt (“Cytolethal Distending Toxin”) fue descrita por primera vez en 1987 por Johnson y Lior como una nueva toxina producida por Escherichia coli. Es una toxina de tipo AB2 que bloquea el ciclo celular eucariota en las fases G2/M de la mitosis, cosa que provoca una distensión celular de hasta 5 veces el tamaño normal, y finalmente se produce la apoptosis. En la actualidad, la Cdt ha sido descrita en un gran número de bacterias Gram negativas como Vibrio, Helicobacter, o Campylobacter, entre otros. Está codificada por tres genes adyacentes (cdtA, cdtB y cdtC) que muestran diferentes grados de similitud entre géneros, siendo CdtB la subunidad catalítica que actúa como una ADNasa de tipo I, y CdtA y CdtC las subunidades que transportan a CdtB al núcleo. En E. coli han sido descritas 5 variantes, localizadas en el cromosoma (Cdt-II), en el plásmido pVir (Cdt-III) o rodeadas de secuencias homólogas a genes de fagos de tipo lambda o P2 (Cdt-I, Cdt-IV y Cdt-V). El hecho de que cdt se encuentre en diferentes géneros bacterianos con secuencias adyacentes homólogas a genes de fagos, así como que no aparezca asociado significativamente a otros factores de virulencia, sugiere que estos genes cdt son adquiridos por transferencia horizontal a través de fagos. Estos fagos Cdt pueden ser inducidos a partir de la cepa huésped y transmitir el gen de la toxina a otras cepas, causando la aparición de nuevas cepas virulentas. Además de en ambientes clínicos, se han encontrado fagos Cdt en agua residual y, tal como veremos en este estudio, también en agua de río, hecho que refuerza su potencial papel como transmisores de la toxina en el medio ambiente. Por tanto, un aspecto importante a tener en cuenta es la persistencia y la estabilidad de estos fagos en las diferentes condiciones ambientales. Por ello, en este trabajo, se ha estudiado la estabilidad de los fagos Cdt bajo diferentes condiciones de temperatura (4ºC, 22ºC y 37ºC) y pH (3, 7 y 9), y bajo diferentes tratamientos de inactivación: calor (60ºC y 70ºC, 30 y 60 min), luz UV (1, 5, 10 y 30 min), cloración (1, 3, 5, 10, 20 y 30 min) e inactivación natural. Para ello se han aislado dos fagos Cdt-V de muestras ambientales, y se han monitorizado mediante ensayos de infectividad (ufp/ml) y mediante cuantificación de copias genómicas por qPCR en cada una de las condiciones ensayadas. Además, se han comparado los resultados obtenidos con la estabilidad de fagos Stx, también de elevada persistencia ambiental, bajo las mismas condiciones. Por su propia naturaleza, y tal y como se ha visto en este trabajo y en estudios anteriores, los fagos son mucho más resistentes a ciertos tratamientos de desinfección e inactivación natural que las bacterias huésped, reafirmando su papel como reservorios de genes de virulencia en el medio ambiente. Además, se han descrito ciertas morfologías de fagos que permitirían una mayor persistencia a dichos tratamientos. Si los fagos consiguen sobrevivir a los tratamientos comúnmente utilizados en la eliminación de las bacterias, podrían transducir el gen de la toxina a otras cepas. Por tanto, no se puede descartar su potencial en la generación de nuevas cepas patógenas emergentes. Además de la persistencia de los fagos Cdt-V, también se ha estudiado su capacidad de inducción y de generación de lisógenos, así como su morfología y su estructura genética. Gracias a ello, se ha podido determinar a qué familia pertenecen y observar su capacidad de evolución y adaptación al lisogenizar a un nuevo huésped.

[eng] Cdt toxin (“Cytolethal Distending Toxin”) was first described by Johnson and Lior in 1987. It is an AB5 toxin that blocks the eukariotic cell cycle between G2 and M phases, which distends the cells, since cell division ceases but growth continues. Cdt is produced by different Gram negative pathogenic microorganisms, including Escherichia coli, Vibrio, Campylobacter and Helicobacter, among others. It consists of three subunits (CdtA, CdtB, and CdtC) that are encoded by three adjacent genes. The catalytic subunit CdtB is homologous to DNase I and it is the most conserved gene, and the other subunits act as binding proteins that deliver CdtB into target cells. Five variants of the toxin have been reported in E. coli, located in the chromosome (Cdt-II), in the conjugative plasmid pVir (Cdt-III) or flanked by lambda-like or P2 bacteriophage genes (Cdt-I, Cdt-IV and Cdt-V). The fact that Cdt is present in different microorganisms and, in some cases flanked by bacteriophage genes, and not significantly associated to other virulence factors, suggest that cdt genes are acquired by horizontal transfer by means of bacteriophages. These Cdt phages could be induced from the host and transduce the toxin to other strains, causing the emergence of new virulent strains. Cdt phages have not only been isolated from clinical samples, but also from environmental samples. For the potential role of these phages in cdt transduction, it is important to consider and study the persistence of Cdt phages in different environmental conditions. In this work, it has been studied the stability of two Cdt phages isolated from the environment under different conditions and inactivation treatments (temperature, pH, heat treatment, UV treatment, chlorination and natural inactivation). Moreover, the results were compared with Stx phages stability (that also have a significantly environmental prevalence) under the same conditions. The fact that Cdt and Stx phages and, in general, all phages, are more resistent to all the treatments and conditions than their natural hosts, reinforces their potential role as a reservoir of virulence genes in the environment. We have also characterized Cdt phages: its capacity of induction and lisogenization, morphology and genetic structure, to understand better the performance of these phages