Papel de la tirosina quinasa Ack1 en la neuritogénesis y señalización regulada por neurotrofinas y moléculas de guía axonal

Abstract

[spa] Ack1 es una proteína tirosina quinasa citoplasmática que pertenece a la familia de proteínas Ack que está formada por 9 miembros. Ack1 está compuesta por varios dominios de interacción proteína-proteína y un dominio catalítico tirosina quinasa cuya autofosforilación regula parcialmente la función de la proteína (Lougheed et al., 2004). Ack1 se encuentra altamente expresada en cerebro (Urena et al., 2005; La Torre et al., 2006), principalmente en las zonas del hipocampo, corteza cerebral, bulbo olfativo y cerebelo (Urena et al., 2005). Además, se ha demostrado que Ack1 se localiza tanto en dendritas como en regiones presinápticas y su expresión se regula a la alza por un incremento de actividad neuronal (Urena et al., 2005). Las funciones fisiológicas de Ack1 son bastante desconocidas. En conjunto, los datos publicados hasta la actualidad destacan la capacidad de la proteína Ack1 para interaccionar con una gran variedad de proteínas, que indica que Ack1 puede participar en diferentes rutas de transducción de señales, y por tanto, participar en diferentes procesos fisiológicos de las células. Por ejemplo, se ha descrito que puede participar en la regulación del citoesqueleto de actina (Burbelo et al., 1995), en los procesos de endocitosis (Teo et al., 2001), en las cascadas de señalización que resultan de la adhesión celular (Bourdoulous et al., 1998), en la migración celular (Modzelewska et al., 2006), en la proliferación (Nur et al., 2005) y en la supervivencia (Mahajan et al., 2005). La mayoría de funciones de Ack1 conocidas se deducen de las interacciones moleculares de ésta y hasta la actualidad se dispone de muy pocos datos respecto a las competencias biológicas de esta proteína, especialmente a nivel de SNC. Por eso, en esta tesis hemos intentado determinar el papel de la tirosina quinasa Ack1 en las funciones del SNC mediante 5 capítulos de resultados. En el capítulo I explicamos la producción de un anticuerpo monoclonal contra Ack1 que produjimos con el objetivo de poder estudiar la proteína Ack1 a nivel funcional. Este anticuerpo lo produjimos contra la región rica en prolinas de Ack1 con el fin que nos permitiera aumentar la especificidad de nuestros experimentos. En el capítulo II caracterizamos la proteína Ack1 a nivel más funcional. Demostramos que Ack1 es un componente de la vía de señalización de las neurotrofinas, siendo fosforilada en respuesta a neurotrofinas e interaccionando con sus receptores Trk. Además, también describimos que cambios de expresión de Ack1 alteran la neuritogénesis en células PC12 y los patrones de ramificación axonal y dendrítico en neuronas de hipocampo y células granulares de cerebelo. En el capítulo III examinamos la interacción de Ack1 con las proteínas de la densidad postsináptica CaMKII y PSD-95, su fosforilación en respuesta a los estímulos excitadores NMDA y glutamato, y la afectación de los botones axonales de las ramas colaterales de Schaffer por una falta de expresión de Ack1. Los resultados obtenidos en este capítulo apuntan a una posible implicación de Ack1 a nivel de terminales sinápticos. En el capítulo IV nos centramos en estudiar la interacción de Ack1 con la proteína FAK y su participación en procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1. Los datos obtenidos sugieren una interacción entre ambas proteínas, que Ack1 se fosforila en respuesta a Netrina-1 y una implicación de la proteína Ack1 en los procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1 en células de hipocampo. Finalmente, siendo las proteínas Ack1 y FAK unas proteínas que dependen de su estado de fosforilación para regular su actividad, en el capítulo V de resultados de esta tesis estudiamos las dianas de fosforilación y posibles proteínas de interacción de ambas proteínas, mediante la técnica de espectrometría de masas en muestras de cerebro de ratón en desarrollo, de cerebro de ratón adulto y de cerebro de ratón adulto hiperestimulado. - Bibliografía Bourdoulous S, Orend G, MacKenna DA, Pasqualini R, Ruoslahti E (1998) Fibronectin matrix regulates activation of RHO and CDC42 GTPases and cell cycle progression. The Journal of cell biology 143:267-276. Burbelo PD, Drechsel D, Hall A (1995) A conserved binding motif defines numerous candidate target proteins for both Cdc42 and Rac GTPases. The Journal of biological chemistry 270:29071-29074. La Torre A, del Rio JA, Soriano E, Urena JM (2006) Expression pattern of ACK1 tyrosine kinase during brain development in the mouse. 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Teo M, Tan L, Lim L, Manser E (2001) The tyrosine kinase ACK1 associates with clathrin-coated vesicles through a binding motif shared by arrestin and other adaptors. The Journal of biological chemistry 276:18392-18398. Urena JM, La Torre A, Martinez A, Lowenstein E, Franco N, Winsky-Sommerer R, Fontana X, Casaroli-Marano R, Ibanez-Sabio MA, Pascual M, Del Rio JA, de Lecea L, Soriano E (2005) Expression, synaptic localization, and developmental regulation of Ack1/Pyk1, a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in the developing and adult brain. The Journal of comparative neurology 490:119-132.

[eng] Ack1 is a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in Central Nervous System (Urena et al., 2005; La Torre et al., 2006) that has several protein-protein interaction domains and a catalytic domain that is autophosphorylated, and this process regulates, at least in part, the action of this protein (Lougheed et al., 2004). Moreover, it has been demonstrated that Ack1 is localized in dendrites and presynaptic regions and that its expression is up-regulated by an increase of neuronal activity (Urena et al., 2005). Most of the known functions of Ack1 have been elucidated from interactions of Ack1 with several proteins. But, most of the physiologically functions of Ack1 remain to be described, especially in CNS. For this reason, the aim of this thesis has been to unravel some of these functions on CNS that are described through 5 chapters. In the 1st chapter we have explained the production of a monoclonal antibody against Ack1 that allowed us to improve the specificity of our experiments and to study Ack1 at a functional level. In the 2nd chapter we have demonstrated that Ack1 is a component of the neurotrophin pathway, because it is phosphorylated as a response to neurotrophins and interacts with Trk receptors. Moreover, we also have described how changes in Ack1 expression alter neuritogenesis and axonal and dendritic ramification. In the 3th chapter we have analyzed the interaction of Ack1 with the postsynaptical proteins CaMKII and PSD-95, its phosphorylation in response to excitatory stimulus such as NMDA or glutamate and we have described that a lack of Ack1 expression decrease the size of axonal buttons. These data suggest an implication of Ack1 at a synaptic level. In the 4th chapter we focused on the determination of the interaction of Ack1 and FAK, the Ack1 phosphorylation in response to Netrin-1 and the effect of Ack1 in chemoattraction regulated by Netrin-1. Finally, in the 5th chapter we studied the phosphorylation sites and the possible interacting proteins of FAK and Ack1 by mass spectrometry in samples of mice brain in development, of adult mice brain and of adult mice overstimulated brain. - Bibliography La Torre A, del Rio JA, Soriano E, Urena JM (2006) Expression pattern of ACK1 tyrosine kinase during brain development in the mouse. Gene Expr Patterns 6:886-892. Lougheed JC, Chen RH, Mak P, Stout TJ (2004) Crystal structures of the phosphorylated and unphosphorylated kinase domains of the Cdc42-associated tyrosine kinase ACK1. The Journal of biological chemistry 279:44039-44045. Urena JM, La Torre A, Martinez A, Lowenstein E, Franco N, Winsky-Sommerer R, Fontana X, Casaroli-Marano R, Ibanez-Sabio MA, Pascual M, Del Rio JA, de Lecea L, Soriano E (2005) Expression, synaptic localization, and developmental regulation of Ack1/Pyk1, a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in the developing and adult brain. The Journal of comparative neurology 490:119-132.