Bases moleculars de l’activitat antitumoral de la lenalidomida en el limfoma de cèl•lules del mantell

Abstract

[cat]El limfoma de cèl•lules de mantell (MCL) és una neoplàsia limfoide sense tractament curatiu, per la qual cosa es requereix la recerca de nous fàrmacs. La identificació de noves dianes terapèutiques pel MCL i l’estudi del mecanisme d’actuació dels fàrmacs tenen una gran importància translacional. Atès que s’ha observat resposta clínica al fàrmac immunomodulador lenalidomida en pacients de MCL i que el seu mecanisme d’acció encara roman parcialment desconegut, hem volgut investigar si l’expressió i la localització subcel•lular de la ciclina D1, un important regulador del cicle cel•lular sobreexpressat en el MCL, i l’inhibidor de cinases dependents de ciclines, p27KIP1 podrien identificar casos de MCL sensibles a la lenalidomida, i si el fàrmac podria modular els complexos de ciclina D1/p27KIP1. Es va trobar que la ciclina D1 i p27KIP1 s’expressaven de forma coordinada en tots els casos testats de MCL. Les anàlisis d’immunoprecipitació i els assajos de siRNA van suggerir un rol directe de la ciclina D1 en la regulació dels nivells de p27KIP1. L’acumulació nuclear de totes dues proteïnes va correlacionar amb la tumorigenicitat del MCL in vivo, i la sensibilitat a l’activitat de la lenalidomida in vitro i in vivo. El mecanisme d’acció de la lenalidomida va dependre de la depleció de la ciclina D1 i de la dissociació dels complexos ciclina D1/p27KIP1, seguida de l’acumulació citosòlica de p27KIP1, aturada de cicle, apoptosi i inhibició de l’angiogènesi. Per tant, aquests resultats revelen un mecanisme d’acció de la lenalidomida en casos de MCL amb una incrementada tumorigenicitat in vivo que consisteix en la dissociació dels complexos ciclina D1/p27KIP1 i el subseqüent bloqueig de la proliferació i la inducció d’apoptosi. A més, es va analitzar la localització subcel•lular de p27KIP1 en línies cel•lulars en assajos in vitro, i no es va trobar correlació entre els nivells nuclears de p27KIP1 i la proliferació cel•lular. Resultats similars es van trobar en comparar el rati p27KIP1/ciclina D1 amb el percentatge de cèl•lules en fase S. També va ser analitzat el paper de p27KIP1 a mostres primàries in vitro i tampoc no es va trobar correlació. Aquests resultats suggereixen que ni p27KIP1 ni el complex que forma amb ciclina D1 estan implicats en la regulació de la proliferació en mostres de MCL in vitro. Com que el tractament amb bortezomib ha mostrat una activitat clínica prometedora en el MCL però sovint es desenvolupen resistències, hem volgut investigar sobre aquest esdeveniment. Ratolins immunodeprimits van ser inoculats amb línies de MCL amb diferent sensibilitat al fàrmac i a continuació es va procedir a determinar el perfil d’expressió gènica dels tumors i la validació funcional de les signatures gèniques identificades. Vàrem observar una augmentada tumorigenicitat in vivo en els casos de MCL resistent a bortezomib, que va ser associada a trets de diferenciació plasmocítica, com un augment en IRF4. La lenalidomida va ser particularment efectiva en aquest subgrup de tumors, actuant sobre el programa de diferenciació plasmocític i superant la resistència a bortezomib. La inhibició del gen diana d’IRF4, MYC, en les cèl•lules resistents a bortezomib (per knockdown o bé amb CPI203, un inhibidor de proteïnes BET), va induir de forma sinèrgica la mort cel•lular quan es va combinar amb la lenalidomida. En ratolins, l’addicció del CPI203 i la lenalidomida, va promoure la reducció de la càrrega tumoral, implicant la disminució simultània de MYC i d’IRF4 i la inducció d’apoptosi. Aquests resultats suggereixen que la senyalització exacerbada d’IRF4/MYC està associada a la resistència a bortezomib en el MCL in vivo i garanteix l’avaluació clínica de la lenalidomida conjuntament amb el CPI203 en casos de MCL refractaris a bortezomib.

[eng] Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid neoplasm characterized by the overexpression of cyclin D1. Clinical responses to lenalidomide have been observed, although its mechanism of action remains partially unknown. We investigated whether the expression and subcellular localization of cyclin D1 and p27KIP1 could identify MCL cases sensitive to lenalidomide, and whether the compound could modulate cyclin D1/p27KIP1 complexes. We found cyclin D1 and p27KIP1 to be coordinately expressed in all the samples tested. Experiments suggested a direct role of cyclin D1 in the regulation of p27KIP1 levels. The nuclear accumulation of both proteins correlated with MCL cell tumorigenicity in vivo, and sensitivity to lenalidomide activity in vitro and in vivo. Lenalidomide mechanism of action relied on cyclin D1 downregulation and disruption of cyclin D1/p27KIP1 complexes, followed by cytosolic accumulation of p27KIP1, cell proliferation arrest, apoptosis, and angiogenesis inhibition, especially in MCL cases with increased tumorigenicity in vivo. Moreover, we analyzed the subcellular localization of p27KIP1 in cell lines. We then compared the nuclear p27KIP1 protein level or the nuclear p27KIP1/cyclin D1 ratio and the percentage of cells in S phase, and observed no correlation between these parameters. Similar results were found in primary cells from patients. Altogether, our results strongly suggest that p27KIP1 or its complex with cyclin D1 may not be involved in the regulation of MCL cell proliferation in vitro. Bortezomib therapy has shown promising clinical activity in MCL, but the development of resistance is common. Immunodeficient mice were engrafted with MCL cell lines with different levels of sensitivity to the drug, followed by gene expression profiling of the tumors. We observed an increased tumorigenicity of bortezomib-resistant MCL cells in vivo, which was associated with plasmacytic differentiation features, like IRF4 upregulation. Lenalidomide was particularly active in this subgroup of tumors targeting plasmacytic differentiation program, thus overcoming bortezomib resistance. Moreover, repression of the IRF4 target gene MYC in bortezomib-resistant cells (by gene knockdown or CPI203, a BET inhibitor), synergistically induced cell death when combined with lenalidomide. In mice, addition of CPI203 to lenalidomide therapy further decreased tumor burden, involving simultaneous MYC and IRF4 downregulation and apoptosis.