Caracterización molecular y funcional de Small-Ubiquitin-related MOdifier en Arabidopsis thaliana

Abstract

[spa] SUMO, Small Ubiquitin-related MOdifier, es un modificador post-traduccional de la familia de la Ubiquitina, ya que presentan estructuras y mecanismo de conjugación conservados. La unión de SUMO al sustrato puede modificar la actividad, localización y estabilidad de la proteína diana. En plantas, la conjugación de SUMO es un proceso esencial durante los primeros estadíos del desarrollo embrionario y que regula las respuestas de las plantas a hormonas y su adaptación frente a diferentes estreses abióticos y bióticos. La conjugación de SUMO al sustrato es el resultado de la acción secuencial de tres reacciones enzimáticas: la activación de SUMO, catalizada por el heterodímero SAE2/SAE1, la conjugación a la enzima conjugadora SCE1 y su transferencia al sustrato en una reacción facilitada por E3 ligasas. En Arabidopsis, existen cuatro isoformas de SUMO, SUMO1, 2, 3 y 4, y dos isoformas de la subunidad pequeña de la enzima activadora, SAE1a y b. Con el objetivo de analizar las bases moleculares de la función de SUMO in vivo, se ha procedido a la caracterización molecular de la maquinaria de SUMOylación. El análisis bioquímico de los parálogos de SUMO de Arabidopsis ha puesto de manifiesto la existencia de un mecanismo de regulación que permite la conjugación preferencial de las isoformas esenciales AtSUMO1/2. Este mecanismo consiste en una mayor afinidad de la enzima activadora E1 por SUMO1/2, de manera que la primera enzima de la vía seleccionaría la isoforma de SUMO que entra en la cascada de conjugación. Además, en Arabidopsis, existen dos isoformas de la enzima activadora E1 que difieren en la composición de la subunidad pequeña, SAE1a y SAE1b. Plantas mutantes de Arabidopsis que carecen de la subunidad SAE1a presentan deficiencias en las respuestas frente a estrés térmico e hídrico, sugiriendo que la subunidad pequeña podría tener un papel regulador en el mantenimiento de la homeostasis de SUMO in vivo. En resumen, los resultados indican que la enzima E1 activadora regularía la conjugación de SUMO mediante la selección de las isoformas de SUMO que entran en la cascada de conjugación y la cinética de conjugación mediante la expresión diferencial de las isoformas SAE1a y SAE1b. Resultados adicionales indican la existencia de modificaciones post-traduccionales que podrían regular la actividad de la enzima activadora in vivo. Por un lado, se ha identificado un procesamiento del extremo C-terminal de la enzima activadora que participa en la regulación de la localización subcelular de esta enzima. Por otro lado, se ha identificado la SUMOilación de diferentes componentes de la maquinaria de SUMO in vitro, entre los que se encuentran SAE2, SAE1, SUMO y SCE1. Estas modificaciones podrían estar regulando la actividad, estabilidad y localización de estas enzimas in vivo. Los resultados obtenidos han sentado las bases para el desarrollo de una herramienta molecular que permite la inhibición moderada de la SUMOylación in vivo. Esta herramienta consiste en la generación de una forma de SAE2 que actúa como dominante negativo, bloqueando la transferencia de SUMO desde la enzima activadora a la conjugadora. La expresión de este dominante negativo mimetiza los defectos de desarrollo característicos de plantas mutantes que presentan una SUMOilación disminuida, validando esta estrategia para el estudio de la función de SUMO en plantas in vivo. Mediante el uso de estas plantas, se ha establecido que un sistema de SUMOilación funcional es necesario para la activación de las respuestas de defensa de las plantas frente a patógenos. Además, como abordaje adicional para estudiar la función biológica de SUMO, se han realizado aproximaciones proteómicas en semilla y se han identificado proteínas potenciales sustrato de SUMO que podrían regular transiciones de desarrollo en semilla.

[eng] SUMO, Small Ubiquitin-related Modifier, is a post-translational modifier belonging to the ubiquitin family, as they present preserved structures and mechanism of conjugation. In plants, SUMO conjugation is essential in the early stages of embryonic development and regulates plant responses to hormones and abiotic and biotic stresses. SUMO conjugation is the result of the three sequential enzymatic reactions: SUMO activation catalyzed heterodimer SAE2 / SAE1, conjugation to SCE1 conjugating enzyme and its transfer to the substrate in a reaction facilitated by E3 ligases. In Arabidopsis, there are four SUMO isoforms, SUMO1, 2, 3 and 4, and two isoforms of the small subunit of the activating-enzyme, SAE1a and b. In order to analyze the molecular basis of the role of SUMO in vivo, we performed the molecular characterization of SUMOylation machinery. Biochemical analysis of the Arabidopsis SUMO paralogs revealed the existence of a regulatory mechanism that allows the preferential conjugation of the essential isoforms AtSUMO1 / 2, which is mediated by the E1 activating enzyme. Also, there are two isoforms of the activating enzyme E1 which differ in the composition of the small subunit, SAE1a and SAE1b. We have shown that the SAE1a subunit is necessary for maintaining SUMOylation homeostasis in vivo. In summary, the results indicate that the E1 regulates SUMO conjugation by selecting SUMO isoforms entering the conjugation pathway and the conjugation rate by the differential expression of SAE1a/b isoforms. Additional results indicate that post-translational modifications may regulate the activity of the E1-activating enzyme. We have identified a processing of the E1 C-terminus involved in the regulation of its subcellular localization. Furthermore, we have identified the SUMOylation of different components of SUMO machinery, including SAE2, SAE1 SUMO and SCE1. We have advanced our knowledge of the SUMO biology by using a molecular tool that allows moderate inhibition of in vivo SUMOylation. We have engineered an E1 dominant negative which mimics plant responses typical of SUMOylation mutants. By using these plants, we have uncovered a new role of SUMOylation in defense responses against pathogens. Furthermore, proteomic approaches have been identified potential SUMO protein substrates that could regulate seed developmental transitions.