Estudi de la regulació de la proteïna proapoptòtica RTP801 per l’E3 ubiquitina lligasa parkina en la malaltia de Parkinson

Abstract

[cat] Les mutacions del gen PARK2 estan associades amb l‘aparició de parkinsonisme juvenil autosòmic recessiu (AR-JP). A través de diferents mecanismes aquestes mutacions comporten la pèrdua de la funció E3 lligasa de la proteïna parkina, amb el que promouen l’acumulació tòxica de proteïnes que resulta en una lenta però progressiva degeneració i mort neuronal. En aquest treball, s’ha descrit la proteïna RTP801/REDD1, proapoptòtica i reguladora de la cinases de supervivència mTOR i Akt, com a substrat de la parkina. L’E3 lligasa parkina interacciona amb la proteïna proapoptòtica RTP801 i en catalitza la poliubiquitinització K48, facilitant així la seva degradació proteasomal, i contribuint a mantenir-ne els nivells proteics baixos. En efecte, s’ha observat que la pèrdua de funció de la parkina provoca una acumulació de l’RTP801 en models cel·lulars i en ratolins genoanul·lats per parkina (PaKO). L’augment en els nivells de la proteïna RTP801 també és remarcable en seccions post mortem de la substància negra pars compacta (SNpc) i en fibroblasts de pacients amb mutacions patològiques del gen PARK2. Per altra banda, l’expressió ectòpica de la parkina disminueix els nivells proteics de l’RTP801 i exerceix un efecte protector vers la toxicitat dependent de l’elevació d’aquesta, ja sigui per la sobreexpressió ectòpica de l’RTP801 o pel tractament amb la neurotoxina parkinsoniana 6-OHDA. Aquest efecte és dependent de la poliubiquitinització i degradació de l’RTP801, com ho demostra l’absència de protecció vers el mutant no ubiquitinitzable RTP801 K-R. De manera consistent, la parkina mutant inactiva falla en produir aquest efecte protector, mentre que la depleció de la parkina produeix una exacerbació dels efectes deleteris de l’RTP801 i contribueix a la inactivació de la via de supervivència cel·lular mTOR/Akt. Per tot plegat, es proposa que la parkina és capaç de prevenir l’acumulació tòxica de la proteïna proapoptòtica RTP801 en un context parkinsonià. En conjunt, aquests resultats indiquen que l’RTP801 es un nou substrat de l’activitat E3 lligasa de la parkina, y que podria estar contribuint a la neurodegeneració causada por la pèrdua de l’expressió o activitat de la parkina. L’intercanvi d’informació entre neurones és un procés vital que té lloc en els contactes sinàptics, o sinapsis. En aquest treball s’ha demostrat que l’RTP801 es troba especialment expressat en les espines sinàptiques en conjunció amb la densitat postsinàptica dels contactes excitadors. A nivell funcional, s’ha vist que l’RTP801 ectòpica provoca un deteriorament de la transmissió sinàptica excitadora, causat per la disminució en la intensitat de l’expressió de diverses proteïnes sinàptiques. També s’ha determinat que l’efecte deleteri de la toxina 6-OHDA sobre el sistema de neurotransmissió glutamatèrgica és dependent de l’elevació dels nivells sinàptics de l’RTP801. Inesperadament, la manca de parkina tan sols produeix una lleuger increment dels nivells sinàptics de l’RTP801, tal com es dedueix dels experiments realitzats en cultius corticals de rata, i en ratolins PaKO, on inesperadament la proteïna RTP801 es situa preferentment en el compartiment presinàptic. Al contrari que en el teixit humà estriatal post mortem, on l’RTP801 és postsinàptic. La pèrdua d’innervació dopaminèrgica a l’estriat parkinsonià promou un efecte distròfic en les dendrites de les neurones espinoses mitjanes estriatals. En aquest treball s’ha descrit que les mostres estriatals post mortem provinents de pacients parkinsonians presenten una major acumulació de l’RTP801 tant en els homogenats com en les sinapsis, així com una reducció de l’activació de la via mTOR/Akt. Aquestes observacions obren la porta a una possible implicació de l’RTP801 en la disfunció sinàptica estriatal característica de la malaltia de Parkinson.

[eng] Mutations in the PARK2 gene are associated with an Autosomal Recessive form of Juvenile Parkinsonism (AR-JP). These mutations affect parkin solubility and impair its E3 ligase activity leading to a toxic accumulation of proteins within susceptible neurons that results in a slow but progressive neuronal degeneration and cell death. Here, we report that RTP801/REDD1, a pro-apoptotic negative regulator of survival kinases mTOR and Akt, is one of such parkin substrates. We observed that parkin knockdown elevated RTP801 in sympathetic neurons and neuronal PC12 cells while ectopic parkin enhanced RTP801 poly-ubiquitination and proteasomal degradation. In parkin knockout mouse brains and in human fibroblasts from AR-JP patients with parkin mutations, RTP801 levels were elevated. Moreover, in human postmortem Parkinson’s disease (PD) brains with mutated parkin, nigral neurons were highly positive for RTP801. Further consistent with the idea that RTP801 is a substrate for parkin, the two endogenous proteins interacted in reciprocal co-immunoprecipitates of cell lysates. A potential physiological role for parkin-mediated RTP801 degradation is indicated by observations that parkin protects neuronal cells from death caused by RTP801 over-expression by mediating its degradation, while parkin knockdown exacerbates such death. Similarly, parkin knockdown enhanced RTP801 induction in neuronal cells exposed to the PD mimetic 6-OHDA and increased sensitivity to this toxin. This response to parkin loss-of-function appeared to be mediated by RTP801 since it was abolished by RTP801 knockdown. Taken together these results indicate that RTP801 is a novel parkin substrate that may contribute to neurodegeneration caused by loss of parkin expression or activity. In this work it has also been investigated the role of RTP801 in synaptic plasticity. We have observed high RTP801 expression in the postsynaptic compartment in rat striatum, cortex, hippocampus and ventral midbrain. The synaptic sublocalization of RTP801 in human striatum is also clearly postsynaptic. At a functional level, ectopic RTP801 dampens the excitatory synaptic transmission by decreasing the levels of several synaptic markers. It has also been shown that the deleterious postsynaptic effect of 6- OHDA is dependent on RTP801 induction in cortical cultures. Finally, we described that RTP801 accumulates in the synaptosomes isolated from striatal postmortem tissue from PD and AR-JP patients, where we have also described an inactivation of the mTOR/Akt, which may contribute to the striatal synaptic dysfunction in PD.