Movilidad de factores de virulencia del patógeno E. Coli O157:H7 y otros serotipos

Abstract

[spa] Los elementos genéticos móviles (EGMs) tienen la capacidad de transportar el ADN bacteriano y hacer que prácticamente cualquier gen presente en una bacteria pueda ser movilizado a otra. Los bacteriófagos son un tipo de EGM que permiten la movilización de genes de una cepa bacteriana a otra, pudiendo generar nuevas cepas patógenas si el gen que transfieren codifica para una proteína que provoca virulencia. En esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio de los bacteriófagos portadores de genes de virulencia como EGMs. Para ello se estudió, en primera instancia, la presencia de bacteriófagos Stx2 en heces de individuos sanos, dado que se ha demostrado su presencia y capacidad de infección en alimentos aptos para el consumo humano y en aguas residuales. La presencia de fagos Stx en heces humanas aparece como la conexión entre su prevalencia en los alimentos, los cuales al ser ingeridos incorporan los fagos Stx, y su detección en agua residual, como resultado de su excreción. Se detectó la presencia de fagos Stx en las heces de individuos sanos y se evaluó su capacidad infectiva. La evolución de las cepas Shiga toxin Escherichia coli (STEC) se determinó a partir de ancestros stx-negativos y que inicialmente no poseían el resto de genes necesarios para producir la enfermedad. Por ello se estudiaron los genes de virulencia en cepas STEC ambientales, permitiendo observar los diferentes estadios intermedios en las evoluciones de las cepas STEC. Las variantes de stx encontradas fueron stx2a y stx2c, que corresponden a las variantes asociadas a mayor virulencia. El estudio de la distribución de los genes de virulencia según su origen reveló claramente que las cepas que contenían un mayor número de factores de virulencia eran cepas de origen vacuno, seguidas de las de origen humano, siendo el serotipo O157:H7 el que contenía mayor número de genes de virulencia. En general, los genes de virulencia que se detectaron con mayor frecuencia fueron aquellos que no estaban codificados en el denominado locus for enterocyte effacement (LEE). El gen más predominante fue hlyA que codifica para una enterohemolisina seguido por el gen nleC y el gen saa El desarrollo de una matriz para visualizar la distribución de los genes entre sí permitió la detección de dos agrupaciones: el grupo formado por genes codificados en LEE y otros genes como espJ, espM, nleB2, nleC, nleD, nleE, nleF, nleA, nleH1 y tccP; y los genes saa, hlya, stx1, cdt y cif que raramente se encontraban en combinación con otros genes, y probablemente se movilicen independientemente mediante algún tipo de EGM. A continuación, nos centramos en el estudio de los genes no descritos en fagos que parecía que se movilizaban de forma independiente y, más en concreto, en el gen saa. El gen saa codifica para una adhesina que se encuentra en las cepas STEC que no codifican para LEE. Se analizaron las diferentes variantes del gen en las cepas STEC saa+ aisladas y se observó y cuantificó la adherencia a células Hep2. En contacto con un agente inductor como la Mitomicina C, el número de copias del gen saa aumentaba hasta 4 unidades logarítmicas y se observó hibridación positiva con una sonda saa en calvas de lisis. Estos resultados sugieren que saa puede ser un gen movilizado por un bacteriófago o, al menos, movilizado mediante una cápside proteica. La banda de CsCl en la que se detectaba el gen saa se observó por microscopia electrónica revelando una morfología tipo Podoviridae. Se confirmó por proteómica la presencia de proteínas fágicas en la fracción de CsCl donde se detectaba saa, siendo una de ellas homóloga a proteínas tipo gene transfer agents (GTA). A sí mismo, se detectó la presencia de saa en la fracción viral de diferentes muestras de origen animal y humano. Finalmente, dado que el primer paso para que una cepa llegue a ser infectada por un fago es la unión de éste a los receptores de membrana de la bacteria provocando la activación de las respuestas de estrés de membrana, se estudiaron la influencia de los sistemas de estrés de membrana en la conversión lisogénica de la bacteria. Los resultados obtenidos indican que la vía BaeSR está implicada en la formación de lisógenos. A pesar de que los fagos Stx son un grupo muy heterogéneo, este resultado se observó con distintos fagos Stx y se determinó que este efecto se debía a los receptores de membrana BamA.

[eng] In this thesis we focused on studying bacteriophages mobilization of virulence genes as MGE. To achieve this goal we studied the presence of Stx2 bacteriophages in feces of healthy individuals since it has been shown their presence and infectivity in food for human consumption and in wastewater. We were able to detect Stx phages in feces of healthy individuals and their infectivity was evaluated. Virulence genes in environmental STEC strains were studied, allowing the observation of the different intermediate stages in the evolution of STEC strains. Strains from bovine origin showed the largest number of virulence factors, followed by those from human origin, with serotype O157: H7 containing the largest number of virulence genes. In general, the most frequently virulence genes detected were those not encoded in LEE. The most predominant virulence gene was hlyA, which encodes for enterohemolysin, followed by the nleC gene and the saa gene. The development of a matrix to visualize the gene distribution allowed the detection of two different groups: LEE encoded genes and other genes such as espJ, espM, nleB2, nleC, nleD, nleE, nleF, nleA, nleH1 and tccP; and the saa, hlya, stx1, cdt and cif genes rarely found in combination with other genes, which probably are mobilized independently by a MGE. Then, we focused on the study of genes not described in phages that seemed to be mobilized independently, particularly, the saa gene. saa encodes for an adhesine found in LEE-negative STEC strains. The variants of the gene were analyzed in isolated saa+ STEC strains and the adherence to Hep2 cells was evaluated and quantified. In the presence of an inducing agent such as Mitomycin C, the number of saa copies increased 4 log units and positive hybridization plaques were detected by using a saa probe, suggesting that saa could be mobilized by a bacteriophage or, at least, by a protein capsid. The CsCl band in which saa was detected was analyzed by electron microscopy revealing a Podoviridae morphology and by proteomic studies it was confirmed the presence of phage proteins, one of them showing homology to gene transfer agents (GTA) proteins. saa was also detected in the viral fraction of human and animal origin samples. Finally, since the first step for a strain to be infected by a phage is the attachment of the phage to specific receptors on the surface of bacteria triggering membrane stress responses, the influence of membrane stress systems in bacteria lysogenic conversion were studied. We demonstrated that BaeSR is involved in the formation of lysogens and that this effect was due to BamA membrane receptors.