Efecto del uso de codones en la velocidad de traducción de la región codificante de la cápside en poblaciones del virus de la hepatitis A

Abstract

[spa] El virus de la hepatitis A (VHA) pertenece a la familia Picornaviridae y posee un genoma de ARN de polaridad positiva con una longitud de aproximadamente 7500 nucleótidos. El VHA como otros virus ARN existe in vivo como distribuciones dinámicas de variantes de genomas cercanamente relacionadas, conocidas como cuasiespecies. Dichos genomas están sujetos a continuos procesos de variación genética, competición, complementación, interferencia y selección, que contribuyen al dinamismo de la población y les permite adaptarse a los distintos ambientes. El VHA posee una serie de características únicas que lo diferencian del resto de los miembros de la familia Picornaviridae. Entre ellas se encuentra el hecho de que posee un IRES de tipo III en su extremo 5’NCR, el cual es una extensa estructura secundaria altamente compleja, que posee una eficiencia muy baja en dirigir la traducción. Otra característica es que el VHA no tiene la capacidad de inducir shut-off o silenciamiento de la síntesis proteica celular. Además, el VHA posee un uso de codones que ha evolucionado de manera natural para ser complementario, y en algunos casos opuesto al de las células humanas, y se conoce como uso de codones deoptimizado. Por tanto, el VHA nunca adopta como codones abundantes aquellos que son altamente utilizados por la célula hospedadora, lo cual ha sido interpretado como una estrategia sutil para evitar en la medida de lo posible la competencia por los ARNt celulares. En el presente trabajo se estudió in vivo el efecto del uso de codones en la velocidad de traducción, en dos regiones de la cápside de cuatro poblaciones del VHA adaptadas a replicar en diferentes condiciones de silenciamiento celular, inducido artificialmente con la utilización de la droga Actinomicina D (AMD). Estas cuatro poblaciones se adaptaron a replicar en ausencia de silenciamiento (L0), a niveles moderados (0.05 μg/ml de AMD, F0.05LA), a niveles altos (0.20 μg/ml de AMD, F0.2LA), y la última era una población de crecimiento rápido (HM175-HP) obtenida como resultado de un evento de molecular breeding y que estaba adaptada a replicar a niveles moderados de silenciamiento celular. Se obtuvieron cuasiespecies de cada una de las dos regiones estudiadas y para las cuatro poblaciones del VHA. Se estudió su velocidad de traducción utilizando vectores bicistrónicos que poseen clonado el IRES del VHA. Se observó que cambios puntuales en el uso de codones que inducían la aparición de codones menos frecuentes, tenían como consecuencia la disminución de la tasa de traducción, que era en mayor o menor medida dependiendo de la significancia de la pérdida de frecuencia y del contexto en el cual tenía lugar el cambio. También se vio que cambios puntuales que inducían una optimización, es decir, presencia de codones más abundantes, conllevaban a un aumento de la tasa de traducción. Asimismo, se encontró que la existencia de optimización/deoptimización concomitante en un mismo individuo o haplotipo podía tener como consecuencia la recuperación de la tasa de traducción perdida, por efecto de codones poco frecuentes o incluso un incremento significativo de la misma, dependiendo de los cambios de codones que estaban participando. Por otra parte, se introdujeron en todos los haplotipos obtenidos para las diferentes poblaciones en estudio, 3 mutaciones en el IRES, U359C, U590C y U726C, que previamente se había visto en nuestro laboratorio que incrementaban su actividad de forma significativa. Se concluyó que estas mutaciones del IRES modificaban el efecto del uso de codones en las tasas de traducción. A su vez, beneficiaban de forma muy relevante a aquellos haplotipos que habían previamente evolucionado para traducir significativamente más rápido. También tenían un efecto positivo en los haplotipos que presentaban deoptimización del uso de codones, permitiendo recuperar la tasa de traducción disminuida. Sin embargo, dichas mutaciones tendían a disminuir la traducción de aquellos haplotipos que conseguían una tasa de traducción normal por efectos compensatorios de optimización/deoptimización local de codones. En la población HM175-HP, las 3 mutaciones del IRES en combinación con un uso de codones optimizado le permitía traducir de una forma significativamente más rápida en las regiones de la cápside analizadas, contribuyendo a que HM175-HP sea una población de rápido crecimiento del VHA con un gran potencial biotecnológico.

[eng] Hepatitis A virus (HAV) is a member of the family Picornaviridae and has a positive single strand RNA genome of about 7500 nucleotides. HAV as a RNA virus exists in vivo as a dynamic distribution of closely related variants, known as quasispecies. In the present work we studied the effect of codon usage on in vivo translation speed using two regions of the capsid. These analyses were performed in four populations of HAV which were adapted to replicate in cell culture in different conditions of cellular transcription shut-off, artificially induced with Actinomycin D (AMD). One population was adapted to replicate in the absence of shut-off (L0), one at moderate levels (0.05 μg/ml AMD, F0.05LA), one at high levels (0.20 μg/ml AMD F0.2LA), and the last one was a fast-growing population (HM175-HP) obtained as a result of molecular breeding events and adapted to replicate at moderate levels of cellular shut-off. An analysis of the translation speed at the quasispecies level was performed for each of the two regions and for the four HAV populations studied, using bicistronic vectors with a HAV IRES cloned. We observed that specific changes in codon usage, which induce the appearance of less frequent codons, resulted in a decreasing translation rate. Also we found that codon changes that induced an optimization, i.e. the presence of more abundant codons lead to an increasing translation rate. The existence of a concomitant optimization/deoptimization in the same haplotype may result in the recovery of the previously lost of translation rate or a significant increase of it, depending on the nature of codon changes. Also, the influence of 3 mutations in the IRES, U359C, U590C and U726C which significantly increase its activity, was also tested. These mutations changed the effect of codon usage on translation rate, inducing a very significant benefit in those haplotypes, whose translations speed had previously evolved to be faster. In addition, they had a positive effect on haplotypes having a more deoptimization codon usage, recovering the previously lost translation rate. However, these mutations tend to decrease the translation rate in those haplotypes having a normal translation rate by a concomitant deoptimization/optimization processes. In the HM175-HP population, the IRES mutations in combination with an optimized codon usage allows a significantly faster translation which contributes to its fast-growing phenotype and thus making it of great biotechnological potential.